TIZ與卵巢癌關系的基因水平研究.pdf

1、卵巢癌是嚴重威脅婦女生命健康的惡性腫瘤，死亡率在女性生殖道惡性腫瘤中居首位，并有上升趨勢。因卵巢生理解剖位置處于盆腔深部，早期卵巢癌患者缺乏典型的臨床癥狀，大部分卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時病變已發(fā)展到晚期。因此在分子生物學水平研究卵巢癌變機理及惡性生物學行為，尋找早期診斷方法，探索有效的治療手段，對于改善患者的預后，提高的生存率，降低死亡率有重要意義。本實驗室前期應用SEREX技術從血清中篩選出卵巢癌相關抗原TIZ，TIZ蛋白在卵巢癌患者血清表達

2、升高，TIZ蛋白聯(lián)合其它血清標志物有助于提高診斷的敏感性和特異性。為了從基因水平進一步了解TIZ與卵巢癌的關系，本實驗通過RT-PCR方法檢測不同卵巢組織里TIZ基因的表達情況、構建TIZ基因真核表達載體及RNA干擾等實驗，研究TIZ與卵巢癌的關系及TIZ對卵巢癌細胞系生物學功能的影響。 目的：探討TIZ基因在卵巢惡性腫瘤組織中的表達及其臨床意義。 方法：采用RT-PCR技術檢測48例卵巢惡性腫瘤、22例卵巢良性腫瘤及2

3、4例正常卵巢組織TIZmRNA的表達情況，分析TIZ基因與卵巢癌的關系。 結果：(1)TIZmRNA在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織、卵巢惡性腫瘤組織中均有表達。TIZmRNA在卵巢惡性腫瘤組織中的表達較正常卵巢組織低(p<0.05)，TIZmRNA在卵巢惡性腫瘤組織中的表達較卵巢良性腫瘤組織低(p<0.05)；(2)TIZ基因表達與卵巢癌患者組織學類型，病理分級等臨床病理特征及預后無關(p>0.05)。結論：TIZmRNA在卵

4、巢惡性腫瘤組織中表達降低。TIZ基因與抑癌基因作用相同，有抑制卵巢癌的發(fā)生的作用。 目的：通過基因工程技術，擴增出TIZ基因全長，構建其真核表達載體。為進一步研究TIZ與卵巢癌的關系打下基礎。 方法：選取漿液性卵巢癌組織作為模板，提取人卵巢癌組織總mRNA，利用PCR技術進行TIZ基因全長的擴增。將其與真核表達載體pcDNA3.1連接，將連接載體進行酶切和測序鑒定。 結果：成功擴增出TIZ基因全長，并經測序驗證其同源性

5、達99％，測序結果顯示第1551位的T突變成C，但其編碼氨基酸并不改變，屬無意義突變，可以用于后續(xù)實驗研究。 結論：成功從惡性卵巢癌組織中擴增出TIZ基因全長并構建了其真核表達載體pcDNA3.1-TIZ。 目的：了解TIZ基因對卵巢癌細胞生物學功能的影響，分析TIZ在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用；探索其作為早期診斷、治療靶向的價值。 方法：成功構建TIZ基因真核表達載體后，將其轉染入無TIZ基因表達的卵巢癌細胞株H

6、08910，G418篩選后經RT-PCR鑒定，確認獲得穩(wěn)定轉染的H08910/pcDNA3.1-TIZ細胞株。然后進行細胞生長特性、細胞周期變化、克隆形成能力、細胞遷移能力、黏附能力、細胞侵襲能力的實驗。 結果：通過轉染篩選，獲得能夠穩(wěn)定表達TIZ蛋白的卵巢癌細胞株。生長曲線顯示轉染了TIZ基因的卵巢癌細胞株生長速度減慢。流式細胞儀對細胞檢測結果顯示H08910/pcDNA3.1-TIZ組處于增殖狀態(tài)(S+G2+M)的細胞為32

7、.6％，G1期為67.4％，對照組則相應為60.7％和39.3％，其處于增殖周期的細胞減少。兩組的克隆形成率、遷移能力、黏附能力侵、襲能力差異無統(tǒng)計學意義(p<0.05)。 結論：細胞功能實驗結果表明，TIZ能夠抑制卵巢癌H08910細胞的生長能力，對其遷移、侵襲、粘附能力均無影響。 目的：通過構建人TIZ基因的shRNA表達載體，轉染卵巢癌細胞。繼而篩選出穩(wěn)定干擾的細胞株，進行一系列功能實驗。 方法：針對TIZ

8、mRNA的不同區(qū)域設計三組不同的siRNA片段，脂質體法轉染TIZ高表達的人卵巢癌細胞系SKOV3，實時熒光定量PCR檢驗干擾效率，選擇干擾效率最高的siRNA片段構建干擾載體。脂質體法轉染TIZ基因高表達的人卵巢癌細胞系SKOV3并進行G418抗性篩選，獲得穩(wěn)轉細胞株，RT-PCR檢驗TIZ基因受抑制情況，然后進行細胞功能實驗。 結果：用熒光定量PCR對不同siRNA干擾片段的干擾效果進行檢測結果顯示，TIZ-573組相對拷貝

9、數(shù)為0.844±0.756，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。TIZ-573組抑制率最高，其抑制率為61％。構建干擾載體pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573，轉染卵巢癌細胞系SKOV3，獲得穩(wěn)定干擾表達株SKOV3/pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573，RT-PCR檢驗其TIZmRNA表達明顯減少。生長曲線顯示pGPU6/GFP/Neo-TI2-573組比對照組的細胞生長快。流式細胞儀對細胞檢測結果顯示pGPU