基于γ-[18O4]-ATP的蛋白激酶分析方法及新型熒光微珠編碼方法.pdf

1、本論文圍繞部分醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的核心問(wèn)題，包括先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)，靶向輸送和大分子藥物研發(fā)方法，試圖通過(guò)運(yùn)用化學(xué)科學(xué)的方法和技術(shù)來(lái)解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的基礎(chǔ)性問(wèn)題。本文通過(guò)將傳統(tǒng)的有機(jī)合成，蛋白工程，酶學(xué)與領(lǐng)域內(nèi)前沿的納米科學(xué)，熒光編碼技術(shù)和體外進(jìn)化等技術(shù)相整合，建立了若干針對(duì)蛋白激酶分析，藥物靶向輸送，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)手段。這些新建立的技術(shù)手段可以被進(jìn)一步運(yùn)用到疾病，特別是腫瘤的體外診斷和治療中。
　　蛋白激酶占據(jù)人類基因組中的1.

2、7％，被認(rèn)為是一類重要的新藥開發(fā)靶點(diǎn)。在前三章中，作為天然存在的ATP的穩(wěn)定同位素類似物，γ-[18O4]-ATP被通過(guò)化學(xué)手段合成出來(lái)作為一種小分子探針，并被用來(lái)發(fā)展了一種基于質(zhì)譜技術(shù)的非放射性多通道的激酶活性分析方法，也即“SIMPLEX”(Stable Isotopic and MetabolicPhosphate Labeling EXperiment)。與其他方法相比，本方法的核心優(yōu)勢(shì)在于可以適用于所有激酶，并且可以使用未經(jīng)純

3、化的激酶和不需要使用非天然的熒光底物。論文詳細(xì)研究了γ-[18O4]-ATP與天然存在的ATP相比較的穩(wěn)定性和生物等價(jià)性。基于建立的新的分析方法，一個(gè)抑制劑分子針對(duì)多個(gè)激酶的有效性，半抑制濃度和特異性可以通過(guò)便捷的方法進(jìn)行測(cè)定。這一技術(shù)未來(lái)還可以被用于激酶抑制劑的高通量篩選。
　　在第四章中，本文針對(duì)在懸浮芯片技術(shù)中廣泛使用的編碼微珠，開發(fā)了一種基于蛋白自組裝的微珠雙色熒光編碼和抗體修飾方法。這一技術(shù)使用一種被稱為“模塊化修飾和編

4、碼骨架蛋白”（Modular Immobilization and Coding ScaffoldProtein，MICSin）的新型重組蛋白，使復(fù)雜的微珠編碼過(guò)程和高難度的抗體修飾步驟通過(guò)“混合”(Mixing)來(lái)實(shí)現(xiàn)。文章運(yùn)用生物化學(xué)方法和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)了MICSin的抗體結(jié)合特異性及其二維熒光編碼能力。在一項(xiàng)應(yīng)用實(shí)例中，這種基于MICSin的熒光編碼技術(shù)可以被用來(lái)同時(shí)檢測(cè)低至1 ng/mL的三種不同的細(xì)胞因子。值得一提的是，組成M