骨不連細胞體外培養(yǎng)及壓應力刺激對其成軟骨分化影響的研究.pdf

1、目的:
　　探討骨不連瘢痕組織中是否存在一種細胞(NCs)，具有間充質干細胞特性以及壓應力刺激對NCs成軟骨分化的影響。
　　方法:
　　1.骨不連細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　收集人的骨不連瘢痕組織，采用組織塊培養(yǎng)法并結合傳代獲取、純化細胞，觀察細胞形態(tài)和表面標志物的表達，從而對其鑒定。MTT法測定第3、5、9代細胞的增殖情況。
　　2.骨不連細胞的多分化潛能的研究
　　取生長良好的第3代到第5代的細

2、胞，分別用成骨誘導培養(yǎng)基誘導、成脂誘導培養(yǎng)基及成軟骨誘導培養(yǎng)基。于成骨誘導7天，行Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色，于誘導14天，Western-blot檢測ALP，OC，BSP的蛋白含量，于誘導21天，行茜素紅鈣結節(jié)染色;于成脂誘導14天，行油紅O染色，并Western-blot檢測LPL，PPARγ2的蛋白含量;于成軟骨誘導14天后，行番素紅染色，并Western-blot檢測COLⅡ，COLⅩ，SOX9的蛋白含量。
　　3.壓應力對

3、骨不連細胞成軟骨分化影響的研究和分子機制探討
　　收集第三代到第五代細胞，分別給予10KPa，30KPa，50KPa，70KPa壓應力刺激，應用MTT法檢測細胞的增殖能力。于加壓14天后細胞行Q-PCR檢測ColⅡ、ColⅩ、SOX9、TGFβ1的mRNA的含量。采用慢病毒載體介導con-shRNA及TGFβ1-shRNA感染NCs細胞，于96h后行GFP免疫熒光檢測陽性率，并Western-blot檢測TGFβ1表達量。對感染c

4、on-shRNA及TGFβ1-shRNANCs的NCs細胞分成三組，一組為感染con-shRNA未加壓組，一組為感染TGFβ1-shRNA未加壓組，剩余一組為感染TGFβ1-shRNA加壓組。于培養(yǎng)后7天收集細胞行P-smad2，Smad2，TGFβ1，ColⅡ、ColⅩ、SOX9蛋白量的表達。
　　結果:
　　1.經組織塊培養(yǎng)法結合傳代所得到的細胞形態(tài)均一，呈長梭形，接近融合狀態(tài)時可呈現(xiàn)旋渦樣生長，傳第10代細胞的增殖能力

5、減弱，出現(xiàn)寬大梭形，排列紊亂。90％以上的細胞表達CD29和CD44;小于8.5％的細胞表面表達CD34，CD45。經MTT方法檢測，第5代細胞增殖能力最佳。
　　2.骨不連細胞經成骨誘導后，細胞形態(tài)開始逐漸發(fā)生改變，局部變成多角形，寬大梭形，細胞內顆粒增多，最后成集落層疊生長，于誘導7天時Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色陽性，誘導21天茜素紅染色陽性，Western-Blot結果顯示，高表達ALP，OC及BSP;經成脂誘導后細胞形態(tài)由長

6、梭形逐漸變?yōu)閳A形，短梭形，正方形，不規(guī)則形狀，呈現(xiàn)“放射狀觸須”樣改變，最后可見細胞內透亮的脂滴形成。于誘導14天油紅O染色陽性，Western-Blot結果顯示，高表達LPL及PPAR-γ2;經成軟骨誘導后細胞形態(tài)逐漸變成圓形，橢圓形及多邊形。誘導14天番素紅染色陽性，Western-Blot結果顯示，高表達ColⅡ,ColⅩ和SOX9。
　　3.骨不連細胞給予加壓后細胞形態(tài)逐漸增大，成寬大形狀，細胞分泌物增多，細胞質變得模糊。

7、經MTT檢查，細胞增殖能力增強。通過對骨不連干細胞的加壓刺激作用，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞分化標志因子ColⅡ、ColⅩ、SOX9，TGFβ1的mRNA表達水平上調，并隨著壓力增大而上升。采用慢病毒載體介導TGFβ1-shRNA感染NCs細胞，通過GFP熒光檢測顯示，NCs細胞的慢病毒感染率達80％以上。Westernblot檢測TGFβ1表達效率。結果顯示，與對照組(Con-shRNA)對比，TGFβ1表達顯著抑制，證明慢病毒載體TGFβ1-sh

8、RNA能顯著下調細胞中TGFβ1的表達。用TGFβ1-shRNA聯(lián)合壓應力處理細胞，發(fā)現(xiàn)壓應力和TGFβ1-shRNA聯(lián)合處理細胞后，壓應力回復TGFβ1-shRNA對P-Smad2表達的抑制作用。同樣回復TGFβ1-shRNA對成軟骨細胞標志因子ColⅡ，ColⅩ，SOX9蛋白的抑制作用。
　　結論:
　　1.骨不連細胞NCs屬于一種間充質干細胞，具有干細胞的表型及有多向分化能力。
　　2.骨不連細胞NCs經間接壓應