bFGF促鈦表面成骨細胞分化成骨作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　本實驗通過觀察鈦片上成骨細胞生長狀態(tài);記錄不同濃度bFGF，在不同時間點對成骨細胞MTT、ALP等的影響，研究不同濃度的bFGF對成骨細胞增殖、分化及成骨的影響并從中篩選出bFGF作用于成骨細胞的最佳濃度;運用western-blot法檢測蛋白表達的變化，推測bFGF在鈦表面促細胞分化、成骨的機制;通過本實驗研究為進一步的動物實驗及臨床實驗提供基礎。
　　方法:
　　1.將成骨細胞接種于表面粗化處理的鈦片上

2、，體外進行復合培養(yǎng)。采用掃描電鏡觀察鈦片表面形態(tài)及成骨細胞在鈦表面生長情況;采用MTT法對比各組成骨細胞在第1至第5天細胞增殖情況;檢測第4天，第8天及第12天各組ALP的活性;檢測第6天，第12天，第18天及第24天各組OC的OD值。對各組實驗數(shù)據(jù)進行對比分析得出促成骨細胞在鈦表面增殖、分化及成骨的最佳bFGF濃度及將最佳bFGF濃度組與對照組的結果進行統(tǒng)計學分析。
　　2.將成骨細胞接種于消毒的玻片及鈦片上，體外進行培養(yǎng)。采用

3、細胞免疫熒光法，鏡下觀察對比最佳bFGF濃度組與對照組Runx2、OPG及BMP-2蛋白的熒光強度并攝片;采用western-blot法觀察各組Runx2、OPG、BMP-2、p-Akt及Akt蛋白條帶及在各組中添加PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002后各個蛋白的條帶變化。對最佳bFGF濃度組及對照組的蛋白條帶結果進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1.通過掃描電鏡的鏡下觀察，處理過的鈦片表面粗糙、高低不平。通過成骨

4、細胞在鈦表面的鏡下觀察，見細胞在鈦表面生長良好，粗糙的鈦表面有利于成骨細胞的早期附著及鋪展。成骨細胞在粘附及鋪展完成期間基本可見三種形態(tài)，且成骨細胞在24h內基本完成粘附，48h后可以完成細胞的鋪展并發(fā)揮其作用。
　　2.細胞增殖情況:成骨細胞在鈦表面第1至第5天的MTT吸光值（OD值），間接反映了細胞的增殖情況。bFGF組OD值高于對照組，10ng/ml至40ng/ml濃度的bFGF組的OD值隨著時間的增加呈現(xiàn)遞增的趨勢，40n

5、g/mlbFGF濃度的OD值達到最大，隨后呈現(xiàn)遞減的趨勢。因此，40ng/mlbFGF濃度在鈦片上促細胞增殖的效果最佳且高劑量的bFGF濃度對成骨細胞反而出現(xiàn)一定程度的抑制。
　　3.細胞分化及成骨作用的情況:各組在第8天時對成骨細胞促分化的作用強于其他時間點，且無論在任何時間點bFGF實驗組ALP活性均大于對照組。各濃度中，以40ng/ml濃度作用效果最佳。根據(jù)骨鈣素檢測的結果得出，在各組中第18天時骨鈣素分泌含量達最大值，且b

6、FGF實驗組大于對照組。各bFGF濃度中，以40ng/ml作用效果最佳。ALP及OCN檢測結果與MTT結果一致且將ALP及OC的40ng/mlbFGF組與對照組的實驗結果進行統(tǒng)計學分析后，都具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.根據(jù)細胞免疫熒光實驗結果，40ng/mlbFGF組的Runx2，OPG及BMP-2蛋白信號強度大于對照組且鏡下細胞數(shù)量多于對照組。鏡下發(fā)現(xiàn)，40ng/mlbFGF組的成骨細胞形態(tài)發(fā)生變化，與對照組相比，

7、細胞形態(tài)呈梭形且更加細長。對于western-blot實驗，40ng/ml濃度的bFGF作用下，Runx2,OPG，BMP-2與p-Akt蛋白表達均大于其他組，且bFGF組大于對照組。因此，bFGF能促成骨細胞在鈦片分泌蛋白，40ng/ml的濃度效果最佳。根據(jù)40ng/mlbFGF實驗組與對照組的各個蛋白的實驗結果，進行統(tǒng)計學分析后均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)
　　5.在各組中加PI3K/Akt信號通路的抑制劑LY294002

8、后，通過western-blot法檢測，Runx2，OPG，BMP-2與p-Akt蛋白表達均被抑制，其中40ng/mlbFGF組抑制最為明顯，且與對照組比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.bFGF能促進成骨細胞在鈦表面的增殖、分化及成骨的作用且能促進成骨細胞分泌相關蛋白。其中40ng/ml濃度的bFGF作用效果最佳。
　　2.bFGF能通過激活PI3K/Akt信號通路增強成骨細胞在鈦表面的分化及成骨作