MicroRNA調(diào)控肺腺癌中胸腺基質(zhì)淋巴生成素表達(dá)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、相比于正常肺組織，非小細(xì)胞肺癌中胸腺基質(zhì)淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)蛋白的表達(dá)水平升高。但是腫瘤組織中TSLP mRNA的表達(dá)水平并沒(méi)有明顯的升高符合microRNA的調(diào)控規(guī)律。本課題篩選并且驗(yàn)證在肺腺癌中調(diào)控表達(dá)水平的microRNA，并初步探索其調(diào)控機(jī)制。
　　(1)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)標(biāo)本:收集31例肺腺癌手術(shù)患者的腫瘤組織和切緣的正常肺組織。利用TRIzol法提取組織中總RNA，手術(shù)

2、切除標(biāo)本的部分組織利用甲醛固定，石蠟包埋，切片。(2)探索TSLP的表達(dá)和調(diào)控特點(diǎn):利用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)患者手術(shù)標(biāo)本中TSLP蛋白的表達(dá)情況，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法檢測(cè)TSLP的mRNA水平。(3)由于TSLP的表達(dá)情況符合microRNA調(diào)控特點(diǎn)，因此利用生物信息學(xué)軟件（miRanda-mirSVR和Targe

3、tscan）初步預(yù)測(cè)理論上可以結(jié)合人類TSLP基因的microRNA。(4)由于TSLP的mRNA分子在正常肺組織中仍然有較高的表達(dá)水平，因此需要額外選取的5例腺癌組織與正常肺組織成對(duì)的樣本。采用高通量的低密度芯片進(jìn)行分析，從754種microRNA中篩選在腫瘤中低表達(dá)的microRNA，并利用RT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。(6)在確定microRNA和TSLP表達(dá)水平的相關(guān)性后，需在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證microRNA對(duì)于TSLP的調(diào)控作用:將

4、microRNA的模擬物體外轉(zhuǎn)染到肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549內(nèi)，采用免疫印跡法檢測(cè)TSLP蛋白水平的變化，利用RT-PCR法檢測(cè)TSLP的mRNA水平變化。(7)為進(jìn)一步探索microRNA對(duì)TSLP的調(diào)控機(jī)制:將雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和microRNA的模擬物，共同轉(zhuǎn)染到肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549內(nèi)。以點(diǎn)突變型雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒為陰性對(duì)照，檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組熒光信號(hào)水平差異。
　　利用免疫組織化學(xué)染色的方法可以發(fā)現(xiàn)，TSLP主要表達(dá)于細(xì)胞的

5、胞漿中，呈褐色顆粒樣著色。在肺腺癌組織中，相比于正常的肺組織，TSLP的表達(dá)水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。但是利用RT-PCR的方法研究發(fā)現(xiàn)，TSLP的mRNA在腫瘤組織和正常肺組織中均有表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差別。
　　上述現(xiàn)象符合microRNA的調(diào)控特點(diǎn)，因此microRNA可能是調(diào)控TSLP表達(dá)的機(jī)制之一。
　　通過(guò)交叉比對(duì)2種生物信息學(xué)軟件（miRanda-mirSVR和Targetscan）的預(yù)測(cè)

6、結(jié)果，發(fā)現(xiàn)數(shù)百種microRNA具有與人類TSLP的mRNA分子結(jié)合的可能性。為了進(jìn)一步縮小范圍，采用芯片技術(shù)進(jìn)一步篩選。發(fā)現(xiàn)在生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)的microRNA中，芯片結(jié)果顯示共有20種microRNA在腫瘤組織中下調(diào)，分別為hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-519a、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-1、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-489、hsa-miR-27a

7、、hsa-miR-373、hsa-miR-125b、hsa-miR-27b、hsa-mir-142-5p、hsa-miR-206、hsa-miR-380-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-22、hsa-miR-376c、hsa-miR-370、hsa-miR-148b和hsa-miR-148a(P=0.04)。之后通過(guò)較大樣本的RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在以上20種microRNA中，有13種rnicroRNA在肺腺癌

8、組織中顯著下調(diào)，分別為hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-519a、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-1、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-489、hsa-miR-27a、hsa-miR-373、hsa-miR-125b、hsa-miR-27b、hsa-mir-142-5p和hsa-miR-206。
　　將以上13種microRNA的模擬物轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)只

9、有hsa-miR-520c-3p可以顯著下調(diào)TSLP的蛋白水平。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，相比于陰性對(duì)照組，hsa-miR-520c-3p組的熒光素活性顯著下降(P＜0.01)，而在TSLP3'UTR點(diǎn)突變質(zhì)粒組中，這一現(xiàn)象并不存在(P=0.43)。而這種調(diào)控現(xiàn)象同樣是mRNA非依賴性的。轉(zhuǎn)染hsa-miR-520c-3p模擬物到A549細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)相比于陰性對(duì)照，TSLP的mRNA水平輕度下降，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.11)

10、。
　　在肺腺癌組織中，TSLP蛋白的水平顯著上升，但是mRNA水平?jīng)]有明顯變化。這種現(xiàn)象預(yù)示著在對(duì)于TSLP表達(dá)調(diào)控的過(guò)程中，存在著一種或多種轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，例如蛋白酶體降解，microRNA調(diào)控等。其中microRNA作為眾多轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制中非常重要的一類分子，近年來(lái)該領(lǐng)域研究較為深入。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多種microRNA在肺腺癌組織中顯著下調(diào)，并且與TSLP的表達(dá)水平可能具有某種關(guān)系。在經(jīng)過(guò)較大樣本驗(yàn)證，在腫瘤組織中明顯下調(diào)的13