抗增殖蛋白參與定心方減輕心肌缺血再灌注損傷的初步機制.pdf

1、研究背景:
　　 定心方是南方醫(yī)科大學(xué)賈鈺華教授的經(jīng)驗方,經(jīng)過長期的臨床和實驗研究被證實不僅可以有效地防治快速型心律失常而且還可以減輕心肌缺血再灌注損傷[1-1]。前期國家自然基金“心肌缺血及再灌注心律失常的蛋白組基礎(chǔ)與定心方作用機制”的研究通過凝膠雙向電泳和質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)抗增殖蛋白(prohibitins)是定心方的一個作用靶點[5],但其在心肌缺血再灌注損傷中的作用機制尚未明確。
　　 第一章:抗增殖蛋白參與定心方減輕

2、大鼠心肌缺血再灌注損傷的初步機制
　　 目的:
　　 1.研究抗增殖蛋白在心肌缺血再灌注損傷中的表達及定心方的影響。
　　 2.研究定心方在心肌缺血再灌注中對MAPK通路的激活作用。
　　 3.探討抗增殖蛋白參與定心方減輕心肌缺血再灌注損傷過程中與MAPK通路的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.實驗分組:40只SPF級雄性wistar大鼠,體重200-250g,隨機分為假手術(shù)組,心肌缺血再灌

3、注模型組,定心方高、中、低劑量組共5組,每組8只。
　　 2.實驗處理:定心方高、中、低劑量組分別給予37.5g·kg-1·d-1、18.75g·kg-1·d-1、9.375g·kg-1·d-1的藥量,每日分為兩次給藥,連續(xù)灌胃7天；假手術(shù)組和模型組灌服生理鹽水。末次給藥前12h禁食不限水,在末次給藥2h后除假手術(shù)組大鼠外均造模,結(jié)扎左冠狀動脈前降支中上1/3處15min,再灌注30min。
　　 3.檢測指標:術(shù)中記錄

4、大鼠再灌注時段Ⅱ?qū)?lián)心電圖,進行心律失常評分。實驗終點分離左室心肌,提取蛋白,應(yīng)用western blotting法檢測prohibitin、pP38、pJNK、pERK1/2蛋白表達,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,測量累積光密度。
　　 4.統(tǒng)計方法:心律失常評分屬于等級資料,多組間比較采用完全隨機設(shè)計多個樣本的Kruskal-Wallis H檢驗法進行分析。實驗數(shù)據(jù)用平均秩(R)表示。蛋白質(zhì)表達累積光密度(IOD)的比值多組間比較

5、應(yīng)用Kruskal-Wallis H檢驗,組間多重比較應(yīng)用Bonferroni法,數(shù)據(jù)用平均值±標準差((x)±s)表示。抗增殖蛋白與MAPK通路中3個蛋白分別進行兩兩相關(guān)性分析,同時控制通路中其他兩個蛋白對這種相關(guān)關(guān)系的影響作為控制變量。
　　 結(jié)論:
　　 1.定心方通過抑制抗增殖蛋白的應(yīng)激性增高減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。
　　 2.定心方通過激活抗凋亡通路ERK1/2,同時減少促凋亡通路P38、JNK通路

6、的激活減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。
　　 3.抗增殖蛋白可能是通過P38、JNK通路參與定心方減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。
　　 第二章 體外實驗平臺建立
　　 第一節(jié) 定心方含藥血清制備及優(yōu)化
　　 目的:
　　 篩選定心方含藥血清抗氧化應(yīng)激損傷的最優(yōu)制備方法
　　 方法:
　　 48只雄性wistar大鼠,體重200-250g,隨機分為4組,每組12只,分別灌服不同劑量定心方水

7、煎劑,給藥劑量分別為18.75 g·kg-1·d-1、37.5g·g·kg-1·d-1、75 g·kg-1·d-1、150 g·kg-1·d-1,每日藥量分兩次灌胃,連續(xù)給藥七天。末次給藥前12h禁食不禁水,每組分別在末次灌藥后30、60、90、120 min各取3只大鼠腹主動脈采血,分離血清,0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌,56℃滅活30min,每只大鼠血清單獨分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 用Wistar乳鼠制備原代心肌細

8、胞,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種1×104個細胞。每只大鼠含藥血清對應(yīng)一個培養(yǎng)孔,即按藥物濃度和采血時間分組,每組3孔,共16組。含藥血清培養(yǎng)24h后,吸除原培養(yǎng)基,加入含H2O2濃度為200 μ m/L的無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3h。干預(yù)完成后,進行MTT試驗,測量OD值。
　　 OD值屬計量資料,經(jīng)單樣本K-S擬和優(yōu)度檢驗(1-Sample K-S Test)符合正態(tài)分布,實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差((x)±s)表示。本實

9、驗是2因素4水平的設(shè)計,應(yīng)用析因設(shè)計的方差分析法分析其交互效應(yīng)及主效應(yīng),主效應(yīng)間多重比較應(yīng)用Bonferroni法；單獨效應(yīng)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。
　　 結(jié)論:定心方含藥血清抗氧化應(yīng)激損傷時大鼠的給藥劑量是75 g·kg-1·-1,采血時間點是90min藥效最佳。
　　 第二節(jié) 定心方含藥血清成分分析
　　 目的:
　　 檢測定心方含藥血清中部分成分含量
　　 方法:<

10、br>　　 10只wistar雄性大鼠,隨機分為兩組,每組5只。定心方組根據(jù)前節(jié)篩選的定心方含藥血清制備方法,選擇定心方劑量為75 g·kg-1·d-1,末次給藥前12h禁食不禁水,末次給藥90min后采血,分離血清,每只大鼠的血清單獨分裝?？瞻讓φ战M灌服等體積生理鹽水。
　　 每個樣品取血清2ml,加入乙腈16ml,在渦旋器上震蕩5min,3000r/min離心20min取上清液,40℃恒溫,氮氣吹干,加入甲醇1ml于渦旋混

11、合器上溶解,0.22 u m微孔濾膜過濾,即得樣品溶液。篩選高效液相色譜質(zhì)譜條件,考察方法的精密度、線性關(guān)系、穩(wěn)定性、回收率,測定定心方含藥血清鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、丹參酮ⅡA、氧化苦參堿的含量。
　　 結(jié)果和結(jié)論:定心方含藥血清中成分明確的物質(zhì)及濃度是鹽酸小檗堿1.4141±0.0224 μg/ml,鹽酸巴馬汀0.3883±0.0082 μg/ml,鹽酸黃連堿0.4889±0.0156μg/ml,氧化苦參堿0.4

12、663±0.0129 μg/ml,丹參酮Ⅱ A未檢出。
　　 第三節(jié) siRNA轉(zhuǎn)染原代心肌細胞濃度的篩選
　　 目的:
　　 篩選脂質(zhì)體介導(dǎo)化學(xué)合成siRNA轉(zhuǎn)染原代心肌細胞的理想濃度
　　 方法:
　　 當心肌細胞融合至80％搏動良好時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1-2小時,用0.1％胰蛋白酶消化細胞3-5分鐘。重懸細胞,調(diào)整濃度至1×105/ml。細胞懸液接種至六孔板每孔2ml。應(yīng)用siPORTM Ne

13、oFXTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,分別轉(zhuǎn)染濃度為0,5,10,20,30nM Cy3-Negative siRNA分別進行轉(zhuǎn)染24h后,應(yīng)用熒光顯微鏡觀察,及采用流式細胞儀進行轉(zhuǎn)染效率及凋亡率檢測,每項每組應(yīng)用三個孔。
　　 根據(jù)篩選的最佳濃度將PHB siRNA ID s129542(5’-3’GCUUUUAUUGUUACACUUtt)和PHB siRNA ID s217968(5’-3’ACUGUGAAAUUUAAUGAUUtt)稀

14、釋液等量混勻,進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染含有設(shè)置空白對照組,每組均設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48h后,提取蛋白進行western blotting檢測。
　　 siRNA轉(zhuǎn)染效率和細胞凋亡率應(yīng)完全隨機設(shè)計多個樣本比較應(yīng)用Kruskal-Wallis H檢驗法進行分析,多重比較應(yīng)用Bonferroni法。westernblotting檢測的光密度比值兩組間比較應(yīng)用兩個獨立樣本的秩和檢驗采用Mann-Whithey Test檢驗法。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準

15、差(-x±s)表示。
　　 結(jié)論:siRNA可以通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑siPORTM NeoFXTTM介導(dǎo)進入原代大鼠心肌細胞內(nèi),其適宜濃度為30nM。
　　 第三章 抗增殖蛋白參與定心方減輕心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的初步機制
　　 目的:
　　 1.研究抗增殖蛋白在心肌細胞氧化應(yīng)激損傷中的表達及定心方的影響。
　　 2.研究定心方在心肌細胞氧化應(yīng)激損傷中對MAPK通路的激活作用。
　　 3.探討

16、抗增殖蛋白參與定心方減輕心肌細胞氧化應(yīng)激損過程中與MAPK通路的關(guān)系。
　　 方法:
　　 實驗共分為7個組:1.正常組(Normal),2.模型組(H2O2),3.定心方組(H2O2+DXF),4.PHBsiRNA干擾組(H2O2+PHBsiRNA),5.ERK阻斷劑組(H2O2+U0126),6.JNK阻斷劑組(H2O2+SP600125),7.P38阻斷劑組(H2O2+SB203580)。每組設(shè)6個復(fù)孔,分別用于細

17、胞凋亡檢測與提取蛋白,每項各用3孔。siRNA轉(zhuǎn)染24h后,更換培養(yǎng)基,定心方含藥血清干預(yù)各組DMEM培養(yǎng)基含12.5％含藥大鼠血清,其余各組培養(yǎng)基含12.5％空白對照大鼠血清。阻斷ERK、JNK、P38通路各組在46h分別加入相應(yīng)的阻斷劑U012610、SP600125、SB203580使其在培養(yǎng)基中的濃度對應(yīng)為10 μM、25 μM、5 μM。轉(zhuǎn)染48h后,用無血清的DMEM培養(yǎng)清洗培養(yǎng)板,最終加入和H2O2濃度為200 μM的培養(yǎng)

18、基繼續(xù)培養(yǎng)3h。
　　 細胞凋亡率和蛋白質(zhì)免疫印跡測量值累積光密度(IOD)與內(nèi)參的比值,實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(-x±s)表示；多組間比較應(yīng)用完全隨機設(shè)計多個樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗法進行分析,組間多重比較應(yīng)用Bonferroni法。抗增殖蛋白與MAPK通路中3個蛋白分別進行兩兩相關(guān)性分析,同時控制通路中其他兩個蛋白對這種相關(guān)關(guān)系的影響作為控制變量,采用偏相關(guān)分析。
　　 結(jié)論: