長期凍存后同種異體骨髓基質干細胞修復顱骨標準骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：建立可靠、純度高的犬骨髓基質干細胞（bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）的分離純化方法，觀察其在體外擴增、成骨分化的能力。并進一步探索和評估：（1）長期凍存后的BMSCs的成骨分化能力；（2）同種異體BMSCs修復顱骨標準骨缺損的能力；（3）同種異體BMSCs移植是否引起明顯的免疫排斥反應。旨在建立隨用隨取的同種異體BMSCs庫，解決骨組織工程種子細胞的來源問題，促進骨組織工程早日在臨床

2、上廣泛應用。
　　 方法：采用1.077g/ml Ficoll分離液，密度梯度離心法分離Beagle犬骨髓得到BMSCs，體外培養(yǎng)、擴增并用成骨條件培養(yǎng)液進行成骨誘導，進行堿性磷酸酶、茜素紅染色和OPN、OCN、Ⅰ型膠原免疫細胞化學或免疫熒光染色。將大量擴增且成骨誘導后的BMSCs在液氮中冷凍保存6個月，復蘇后接種于β-TCP支架上共培養(yǎng)，構建BMSCs/TCP復合物。在10只平均體重為11.9kg的成年Beagle犬顱骨上分別

3、制造左右兩個直徑為20mm的標準骨缺損，分別為實驗側和對照側。實驗動物共分為三組，分別為同種異體組、自體組和空白組。同種異體組接種的同種異體BMSCs來自于自體組的2只Beagle犬骨髓。自體組接種的BMSCs來自于自體組的2只Beagle犬各自本身，即為相同來源的BMSCs，其分離、純化、成骨誘導后凍存、復蘇、共培養(yǎng)及移植的方法在各組之間完全一致。其中6只為同種異體組，實驗側（左）應用成骨誘導后的同種異體BMSCs/β-TCP復合物修

4、復，對照側（右）單獨應用β-TCP修復。另外2只犬（提供骨髓犬）為自體組，實驗側（左）應用成骨誘導后的自體BMSCs/β-TCP復合物修復，對照側（右）單獨應用β-TCP修復。其余2只犬為空白組，實驗側（左）單獨應用β-TCP修復，對照側（右）為空白對照，不接種任何材料。
　　 應用1-0號絲線封閉切口。采用組織學和影像學方法評估術后16和24周的修復情況。同時監(jiān)測外周血T淋巴細胞亞群CD4+/CD8+的變化，對術后全身免疫反應

5、進行評估。
　　 結果：采用1.077g/ml Ficoll液可獲得純度較高的BMSCs，細胞生長良好，平均倍增時間為24h，經成骨誘導培養(yǎng)后可定向分化為成骨細胞。應用成骨誘導后的凍存半年的同種異體BMSCs復合β-TCP修復Beagle犬顱骨標準骨缺損，無明顯不良反應，所有動物術后均存活，無感染發(fā)生。16周后初步的組織學和影像學檢查表明，同種異體組（6例）的成骨情況良好。免疫學分析表明CD4+和CD8+T細胞數量以及CD4+/