阿拉伯木聚糖溶解、降解機(jī)制的研究及酸性木聚糖酶基因的克隆、表達(dá).pdf

1、大麥中的非淀粉多糖主要由阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖組成，在過(guò)去的40多年，β-葡聚糖在制麥和釀造過(guò)程中的作用已得到研究者廣泛而深入的了解，但對(duì)阿拉伯木聚糖的研究確卻很少。最近研究者開(kāi)始發(fā)現(xiàn)來(lái)源于谷物中的阿拉伯木聚糖會(huì)造成浸出率降低、麥汁粘度升高、過(guò)濾速度減慢、縮短濾膜壽命，甚至造成成品啤酒的渾濁。本文在研究了阿拉伯木聚糖測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，調(diào)研了市售啤酒和啤酒用大麥中阿拉伯木聚糖的含量。系統(tǒng)的研究了糖化參數(shù)對(duì)阿拉伯木聚糖溶解的影響，運(yùn)用數(shù)學(xué)

2、模型預(yù)測(cè)糖化醪中阿拉伯木聚糖濃度，并通過(guò)電子顯微鏡觀察了不同分子量的阿拉伯木聚糖對(duì)膜孔堵塞的情況。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)釀造中阿拉伯木聚糖的酶法降解，對(duì)一株能產(chǎn)酸性木聚糖酶的真菌Aspergillussp.ZH-26進(jìn)行鑒定后，優(yōu)化其產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成，并嘗試了將Aspergillussp.ZH-26酸性木聚糖酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行克隆和表達(dá)。 本文通過(guò)建立糖腈乙?；瘹庀嗌V法測(cè)定啤酒(麥汁)中的阿拉伯木聚糖，測(cè)定了36種市售

3、啤酒中阿拉伯木聚糖的含量在479～1239mg/L，多聚阿拉伯木聚糖的含量在283～849mg/L。測(cè)定了36種國(guó)產(chǎn)主要啤用大麥中總阿拉伯木聚糖含量在3.50％～5.38％，而水溶性阿拉伯木聚糖含量在0.31％～0.67％。利用化學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法研究了啤酒中阿拉伯木聚糖、多聚阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖的含量與啤酒原麥汁濃度、粘度、濁度之間的關(guān)系。結(jié)論如下：阿拉伯木聚糖和多聚阿拉伯木聚糖與粘度的相關(guān)系數(shù)分別為0.766和0.736，都要高于β

4、-葡聚糖與粘度的相關(guān)系數(shù)0.673。啤酒中阿拉伯木聚糖的含量顯著受原麥汁濃度的影響。 系統(tǒng)研究了釀造過(guò)程中阿拉伯木聚糖的溶解變化，及糖化溫度、谷物粉碎細(xì)度和機(jī)械攪拌等糖化參數(shù)對(duì)阿拉伯木聚糖溶解的影響。為了滿足廣大啤酒公司以小麥或小麥芽為輔料降低生產(chǎn)成本的需求，我們采用不同的輔料比、料水比和粉碎細(xì)度，在不同的糖化溫度下，研究了阿拉伯木聚糖的溶解對(duì)麥汁浸出率、麥汁粘度和麥汁過(guò)濾的影響。結(jié)果如下：麥汁和啤酒中的阿拉伯木聚糖主要來(lái)源于谷

5、物中水溶性的阿拉伯木聚糖，以大米為輔料時(shí)會(huì)降低麥汁和啤酒中阿拉伯木聚糖的含量，采用小麥或小麥芽代替輔料和代替麥芽時(shí)，隨輔料比的增加，阿拉伯木聚糖的含量增加，從而增加麥汁粘度，阻礙麥汁過(guò)濾。麥汁粘度受麥汁中水溶性阿拉伯木聚糖含量的影響要高于麥汁中β-葡聚糖含量對(duì)麥汁粘度的影響。糖化溫度能夠促進(jìn)麥芽中水溶性阿拉伯木聚糖的浸出，不溶性的阿拉伯木聚糖在高溫作用下能夠轉(zhuǎn)變?yōu)闊崴扇苄缘陌⒗揪厶?。糖化機(jī)械攪拌顯著影響麥芽中阿拉伯木聚糖的溶解。

6、 通過(guò)構(gòu)建熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)方程，配合計(jì)算機(jī)模擬，建立了能夠模擬糖化過(guò)程中阿拉伯木聚糖的溶解和降解及麥芽?jī)?nèi)源內(nèi)切木聚糖酶隨機(jī)進(jìn)攻的數(shù)學(xué)模型，在給定不同的糖化曲線和初始麥芽條件的情況下能預(yù)測(cè)出最終糖化麥汁中阿拉伯木聚糖的濃度。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模對(duì)此模型進(jìn)行驗(yàn)證，說(shuō)明此模型能較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)糖化麥汁中阿拉伯木聚糖的濃度。進(jìn)一步將此模型在兩家啤酒公司進(jìn)行驗(yàn)證，模型誤差分別為16.8％和17.9％，說(shuō)明此模型也能較為準(zhǔn)確的反應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)的真實(shí)情況，為企業(yè)

7、預(yù)測(cè)阿拉伯木聚糖的風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題和實(shí)現(xiàn)對(duì)糖化過(guò)程中阿拉伯木聚糖的在線檢測(cè)、控制提供了研究基礎(chǔ)。仿真實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，通過(guò)在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行Matlab程序，運(yùn)用建立的模型，我們可以快捷簡(jiǎn)便的對(duì)糖化過(guò)程中阿拉伯木聚糖的溶解和降解進(jìn)行預(yù)測(cè)研究。 為了研究阿拉伯木聚糖是否會(huì)對(duì)微孔濾膜產(chǎn)生堵塞，通過(guò)對(duì)小麥中阿拉伯木聚糖的分離、純化，得到分子量為102kDa、282kDa、389kDa和963kDa的阿拉伯木聚糖，并建立了評(píng)價(jià)阿拉伯木聚糖影響膜堵塞的評(píng)價(jià)體

8、系。通過(guò)建立多元回歸方程發(fā)現(xiàn)，對(duì)于未經(jīng)剪切力作用的啤酒，研究發(fā)現(xiàn)F＞0.22比F＞0.45更容易受到阿拉伯木聚糖濃度的影響。經(jīng)剪切力作用的啤酒與未經(jīng)剪切力作用的啤酒相比，阿拉伯木聚糖的粒徑大小在剪切力作用下會(huì)顯著增加，而且被0.45μm膜截留的那部分阿拉伯木聚糖的比例顯著增加。高分子量的阿拉伯木聚糖在0.45μm和0.22μm膜上的粒徑分布與剪切力和乙醇濃度呈正相關(guān)。與0.22μm膜相比，被0.45μm膜截留的那部分阿拉伯木聚糖更容易受

9、乙醇濃度的影響，但不受pH值的影響。通過(guò)采用電子顯微鏡(SEM)手段，表征了阿拉伯木聚糖能夠堵塞啤酒的膜過(guò)濾，并且隨阿拉伯木聚糖分子量的增加膜堵塞情況更加嚴(yán)重。 阿拉伯木聚糖的酶解定量問(wèn)題是一直困擾著釀造者開(kāi)展木聚糖酶降解阿拉伯木聚糖研究的一大難題，過(guò)去所有的研究報(bào)道只是建立在利用粘度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。我們通過(guò)提出多聚阿拉伯木聚糖(PAX)的概念用以指示高分子量部分的阿拉伯木聚糖，并被美國(guó)釀造學(xué)會(huì)采納，解決了阿拉伯木聚糖的酶解定量難

10、題。通過(guò)在全麥芽和以40％小麥芽為輔料的糖化初始掭加木聚糖酶，說(shuō)明添加木聚糖酶能更多的溶解谷物中的阿拉伯木聚糖，使糖化醪中阿拉伯木聚糖含量升高，但能對(duì)PAX進(jìn)行有效的降解，從而使經(jīng)酶解后的小麥芽麥汁的粘度與全麥芽麥汁達(dá)到相當(dāng)?shù)乃剑瑴p輕糖化過(guò)濾困難的問(wèn)題。進(jìn)而利用響應(yīng)面分析法，確定了糖化過(guò)程降解PAX的最優(yōu)條件為：木聚糖酶加酶量38U/g，糖化初始pH5.5，Ca2+離子濃度為114mg/L。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)不同比例的小麥芽為輔料進(jìn)行糖

11、化，在優(yōu)化條件下加酶后麥汁粘度都能降低到1.44cP左右的水平，說(shuō)明采用較高比例的小麥芽糖化時(shí)通過(guò)外加木聚糖酶的方法能夠消除阿拉伯木聚糖對(duì)麥汁粘度升高、影響過(guò)濾的問(wèn)題。 為了實(shí)現(xiàn)對(duì)阿拉伯木聚糖的酶法降解，從一株分離得到的能產(chǎn)生酸性木聚糖酶的真菌Aspergillussp.ZH-26出發(fā)，通過(guò)對(duì)其形態(tài)特征和ITS保守區(qū)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)該菌進(jìn)行鑒定，并在GenBank上申請(qǐng)登記，登記號(hào)為DQ235784。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)Aspergil

12、lusawamoriZH-26產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，確定為：發(fā)酵初始pH4.0，30℃培養(yǎng)96h，裝液量為30％，搖瓶轉(zhuǎn)速為150r/min，接種量為1×106孢子/mL。通過(guò)Plackett-Burman多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對(duì)影響AspergillusawamoriZH-26產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)基組成進(jìn)行了篩選，所選取的17個(gè)影響因素為：酵母膏、胰蛋白胨、尿素、NH4C1、(NH4)2SO4、NaNO3、KH2PO4、K2HPO4、

13、NH4NO3、MgSO4、CaCl2、CuSO4、ZnCl2、FeSO4、MnSO4、維生素B1、EDTA。方差分析表明，影響AspergillusawamoriZH-26產(chǎn)木聚糖酶的主要因素為酵母膏、胰蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4、CaCl2。進(jìn)一步通過(guò)響應(yīng)面分析法和典型性分析得出培養(yǎng)基最優(yōu)條件：酵母膏5.95g/L、胰蛋白胨6.79g/L、(NH4)2SO413.37g/L、KH2PO41.14g/L和CaCl20.81

14、g/L，預(yù)測(cè)木聚糖酶最大酶活Ymax=46.90U/mL。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)證明在優(yōu)化條件下，AspergillusawamoriZH-26產(chǎn)木聚糖酶達(dá)47.26U/mL。 為了更好的研究酸性木聚糖酶的性質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)其潛在的工業(yè)化應(yīng)用前景，我們從分子水平對(duì)其進(jìn)行了研究。利用overlap-PCR技術(shù)，成功的克隆到了去除內(nèi)含子的AspergillusawamoriZH-26酸性木聚糖酶(xynA)cDNA結(jié)構(gòu)基因，將其接入到表達(dá)載體pTrc