胰島移植治療糖尿病的臨床前研究.pdf

1、糖尿病是對人類生命健康危害最為嚴(yán)重的疾病之一。胰島移植是二十世紀(jì)七十年代建立的一種治療糖尿病的技術(shù)方法，特別是本世紀(jì)采用Edmonton胰島方案以來，胰島移植已經(jīng)發(fā)展成為一項成熟的技術(shù)，成為糾正糖代謝紊亂，防治并逆轉(zhuǎn)糖尿病慢性并發(fā)癥的有效方法。 目的：建立人胰島分離、純化和功能評價的技術(shù)方案，并應(yīng)用該方案對所分離和純化的人胰島進(jìn)行體內(nèi)、外功能的評價和安全性評估，為開展臨床胰島移植奠定基礎(chǔ)，為并申報胰島細(xì)胞治療臨床準(zhǔn)入批文提供系統(tǒng)

2、的數(shù)據(jù)資料。 方法：獲得成人尸體胰腺供體6例，采用膠原酶消化法及密度梯度離心法分離和純化人尸體胰腺供體的胰島，經(jīng)雙硫腙(DTZ)染色計數(shù)并分析胰島細(xì)胞的純度。通過AO/PI染色評價分離胰島的活力；通過電子顯微鏡觀察胰島素分泌顆粒；采用免疫熒光染色分析分離胰島的細(xì)胞組成和分布：通過RT-PCR檢測分離胰島主要激素和自身抗原mRNA的表達(dá)；通過靜態(tài)葡萄糖刺激檢測胰島素分泌功能；將分離的人胰島移植到糖尿病小鼠評價胰島的代謝功能；并對分

3、離胰島的產(chǎn)品進(jìn)行細(xì)菌污染，內(nèi)毒素含量和凝血活性等安全性指標(biāo)的檢測。 結(jié)果：成人尸體胰腺供體6例，冷缺血時間10-12個小時，胰腺重量65.61±19.31(41.30-94.87)g，未消化組織重量15.09±8.21(7.44-26.85)g，消化組織的重量為50.52±19.56(33.86-83.45)g：分離純化后胰島的數(shù)量為22.9±3.1萬IEQs(4970±1620IEQs/g組織)；經(jīng)不連續(xù)密度梯度純化后，胰島的

4、純度為59.0％±8.9％(49％-70％)；吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色顯示，分離胰島的活力為89％±3％(85％-94％)；RT-PCR表明，分離胰島的胰島素、胰高糖素、IA2、IAR、ICAp69以及GAD65mRNA表達(dá)陽性；靜態(tài)葡萄糖孵育刺激胰島素釋放的刺激指數(shù)(SI)為8.1±4.0(3.8-10.2)；透射電鏡掃描可見分離的胰島細(xì)胞中有大量的胰島素分泌顆粒；冰凍切片的免疫熒光染色顯示分離胰島中C-肽(C-peptid

5、e)陽性細(xì)胞占大多數(shù)，主要分布于胰島的中心部位，胰高糖素(glucagon)陽性細(xì)胞次之，主要分布在胰島的周邊部位，生長抑素(somatostatin)陽性細(xì)胞較少，主要散在分布于胰島內(nèi)，胰多肽(pancreaticpolytide)陽性細(xì)胞很少，主要分布于胰島的周邊；凍存復(fù)蘇后的胰島經(jīng)AO/PI染色觀察胰島的活力為85％；凍存復(fù)蘇后的胰島經(jīng)靜態(tài)葡萄糖刺激后，胰島素分泌的刺激指數(shù)為2.5；將分離純化后的人胰島移植于鏈脲菌素(STZ)制備

6、糖尿病裸鼠的左腎包膜下，發(fā)現(xiàn)治療組血糖3天后降至正常水平并長期保持；切除接受了胰島移植的左側(cè)腎臟后，糖尿病裸鼠的血糖明顯升高；對分離胰島的培養(yǎng)上清進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的檢測，結(jié)果為陰性，胰島培養(yǎng)上清中內(nèi)毒素含量＜0.5EU/ml，凝血活性＜300U/ml。這些結(jié)果和技術(shù)指標(biāo)已經(jīng)全面達(dá)到或超過美國邁阿密胰島移植中心和賓夕法尼亞胰島移植中心的技術(shù)指標(biāo)。 結(jié)論：采用我們制定的胰島分離、純化技術(shù)方案所分離的人胰島在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、數(shù)量、純度、活力、