雌激素受體在去勢大鼠牙周膜干細胞成骨分化中作用的研究.pdf

1、絕經(jīng)后婦女易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，已證實這一現(xiàn)象和體內(nèi)的雌激素缺乏有關(guān)，雌激素水平降低可加速體內(nèi)的骨轉(zhuǎn)換過程，導致骨吸收大于骨形成，從而使體內(nèi)的骨量減低，引發(fā)骨質(zhì)疏松。如今，骨質(zhì)疏松已被認為是誘發(fā)牙周疾病及牙齒喪失的危險因素之一。通過對絕經(jīng)后婦女的臨床研究表明，在口腔衛(wèi)生保持不變的情況下，雌激素缺乏的患者牙周病發(fā)病率升高。動物實驗也已經(jīng)證實，去除卵巢的雌性大鼠其下頜骨密度降低。然而，雌激素缺乏對牙周組織影響的分子機制仍不明確。
　　牙周膜

2、（periodontalligament，PDL）是一種特殊的、富含血管的連接牙骨質(zhì)和牙槽骨的組織，它的存在使得牙齒被固定在牙槽窩里。以往研究表明，在人的牙周膜中含有一些異質(zhì)性的細胞群體，這些細胞能夠在體外分化為成牙本質(zhì)細胞及成骨細胞。2004年，施松濤教授等人證實，牙周膜韌帶中含有牙周膜干細胞（periodontalligamentstemcells，PDLSCs），此類細胞對牙周組織的再生有著至關(guān)重要的作用。
　　雌激素積極地

3、參與骨代謝過程并且有著多功能的調(diào)控作用，這在很多研究中已得到證實。它對靶細胞的調(diào)控作用主要通過雌激素受體（estrogenreceptor，ER）發(fā)揮作用。雌激素受體存在于很多細胞中，比如骨髓基質(zhì)干細胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs），牙周膜成纖維細胞（periodontalligamentfibroblast，PLF）中，并且，在這些細胞的成骨分化過程中，雌激素受體起到了重要的調(diào)控作用。但具

4、體的調(diào)控機制不明。
　　因此，我們利用去勢大鼠營造了一個低雌激素的微環(huán)境，提取其牙周膜干細胞，觀察其成骨分化的過程，進而研究雌激素受體在此過程中的調(diào)控作用以及分子機制。實驗設計如下：
　　實驗內(nèi)容：
　　（1）去勢大鼠骨質(zhì)疏松動物模型建立
　　實驗分為兩組：去勢組和假手術(shù)組。實驗組采用外科手術(shù)的方法，切除雌性SD大鼠的雙側(cè)卵巢（ovariectomy，OVX），建立骨質(zhì)疏松的動物模型，假手術(shù)組切除卵巢周圍少量脂肪

5、組織。3個月后，觀察兩組大鼠體重、血清雌激素水平以及股骨骨密度（BMD）。
　?。?）去勢大鼠牙周膜干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　動物模型構(gòu)建成功后，拔出兩組大鼠的4個第一磨牙，刮下根中部表面上的牙周韌帶組織，采用酶消化+組織塊法培養(yǎng)原代細胞，利用免疫磁珠技術(shù)對此種細胞進行篩選、純化，從而獲得STRO-1高表達的牙周膜干細胞。利用倒置顯微鏡觀察、增殖速率的測定比較兩組大鼠生物學特性的區(qū)別。而后，通過流式細胞儀檢測及成骨誘導鑒

6、定獲得的牙周膜干細胞。
　?。?）雌激素受體對去勢大鼠牙周膜干細胞成骨分化能力的影響
　　利用實時定量PCR的方法，觀察大鼠牙周膜干細胞成骨分化過程中雌激素受體及成骨指標的變化。而后，在雌激素刺激及慢病毒干涉載體下調(diào)雌激素受體后，檢測成骨指標的變化。
　　（4）雌激素受體對去勢大鼠牙周膜干細胞Notch信號通路的影響
　　文獻表明，Notch信號通路與細胞的成骨分化關(guān)系密切，因此，本實驗擬以Notch信號通路為切

7、入點，初步探討雌激素受體影響牙周膜干細胞成骨能力的分子機制。首先，觀察了牙周膜干細胞成骨分化過程中Notch受體（Notch1）及配體（Jagged1）基因和蛋白的表達，而后，檢測了雌激素刺激后及下調(diào)雌激素受體表達后Notch信號通路的變化。
　　結(jié)果：
　?。?）術(shù)后3個月，兩組間大鼠體重、雌激素水平及股骨骨密度均具有統(tǒng)計學差異。去勢組大鼠體重增加，雌激素水平和股骨骨密度降低。
　?。?）通過流式細胞儀分析，與未篩選

8、前的牙周膜細胞相比，牙周膜干細胞呈現(xiàn)STRO-1及CD146的高表達，這表明我們獲得了純化較好的牙周膜干細胞。MTT結(jié)果顯示，去勢后，大鼠牙周膜干細胞增殖速率變快。
　?。?）牙周膜干細胞成骨誘導過程中，去勢組牙周膜干細胞的堿性磷酸酶活性、雌激素受體及成骨基因的表達低于假手術(shù)組，茜素紅染色結(jié)果證實了以上結(jié)論。最后，在17β-雌二醇的刺激下，牙周膜干細胞的成骨分化能力增強；下調(diào)ERα和ERβ表達后，牙周膜干細胞的成骨分化能力減弱。<

9、br>　　（4）Real-timePCR及Westernblot的結(jié)果表明，去勢大鼠牙周膜干細胞的成骨分化過程中，Notch信號通路中受體Notch1、配體Jagged1在基因及蛋白的水平上均有表達。給予雌激素刺激后，Notch受體和配體的表達都有不同程度升高；下調(diào)ERα和ERβ表達后，Notch受體和配體表達升高的程度降低。
　　結(jié)論：
　?。?）去勢大鼠牙周膜干細胞的增殖能力增強但成骨能力減弱，雌激素受體在雌激素介導的牙