雌激素受體-α在骨髓間充質干細胞中的表達及對成骨分化影響的研究.pdf

1、雌激素和機械力都是調控骨改建的重要條件。由于絕經期婦女雌激素缺乏，具有骨代謝方面的特殊性，同時，與口腔應力負荷有關的牙周治療、顳下頜關節(jié)病治療、口腔修復和成人口腔正畸也日益普及，因而相應的臨床與基礎研究開始出現(xiàn)?？谇画h(huán)境里，牙齒承擔咀嚼功能，故而，牙槽骨及關節(jié)的骨改建中，力學影響不容忽視。雌激素和機械力在調節(jié)骨改建的過程中，均已有研究涉及到雌激素受體的介導作用，然而雌激素與機械力復合條件下，雌激素受體-α介導骨改建的機制究竟能否追溯到作

2、為成骨細胞來源的骨髓間充質干細胞，至今仍有待于進一步的實驗論證。 本研究擬分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs），經礦化成骨誘導液處理，在雌激素、流體剪切力等誘導條件下通過免疫組化、免疫蛋白印跡、實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time PCR）等方法觀測雌激素受體的表達及活性。在阻斷雌激素受體的情況下觀察其成骨能力的變化。進一步還可以觀察雌激素和流體剪切力對骨髓間充質干細胞的雌激素受體及成骨能力的影響是否具有協(xié)同性作

3、用。研究內容如下： 1．骨髓間充質干細胞的分離純化培養(yǎng)鑒定 為了獲得相對均一的原代培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質干細胞，本實驗綜合了密度梯度離心法和全骨髓自然貼壁篩選法的優(yōu)點，從雌性SD大鼠股骨中分離、純化培養(yǎng)出BMSCs，并通過倒置顯微鏡觀察、MTT細胞生長曲線、克隆形成等生物學行為觀察，初步判斷其活力和均一性。再經過流式細胞儀對其表面標志物進行檢測確定了其具有骨髓間充質細胞的陽性CD29和CD44表面抗原，同時由于表面抗原C

4、D11b和CD45的陰性結果而排除了其為造血干細胞的可能。再經干細胞表面標志STRO-1陽性染色及成骨、成脂等多向分化誘導，獲得了Von kossa染色的類成骨細胞和油紅-O（Oil red O）染色的類脂肪細胞，從而正反論證、確認了所分離培養(yǎng)的細胞即為BMSCs。 2．雌激素受體-α（Erα）在BMSCs中的動態(tài)表達 本研究旨在觀察BMSCs中的雌激素受體在成骨分化中的作用，故通過細胞免疫蛋白印記和免疫化學的方法確證

5、了Erα在BMSCs細胞核的陽性表達。 同時為了獲得在成骨分化中Erα的信息，本實驗又利用具有量化檢測功能的實時熒光定量PCR技術（real-time PCR）對Erα的基因表達依BMSCs的培養(yǎng)階段進行了動態(tài)觀測，發(fā)現(xiàn)Erα Mrna會隨細胞的增殖分化、基質分泌礦化等過程發(fā)生基因豐度水平的變化。在相當于增殖完成進入分化期時，基因豐度迅速達到平臺期，并高位持續(xù)至成骨分化的礦化階段。 3．雌激素對BMSCs成骨分化的影響

6、 本實驗目的是觀察生理濃度的雌二醇（E2）能否增強經過礦化誘導的BMSCs的成骨分化效應。 在不同濃度梯度的E2作用下，BMSCs的增殖和堿性磷酸酶（ALP）活性經MTT細胞生長曲線以及ALP活性測試等實驗證明均有不同程度的提高，其中尤以10-6M的E2作用明顯。再通過不同時間梯度發(fā)現(xiàn)在此濃度條件下，ALP表達增強并有時間依賴性。更重要的是，以上成骨效應在用雌激素受體阻斷劑ICI182780處理后，均有明顯降低，提示了雌

7、激素受體在此過程中可能具有一定的中介作用。 4．流體剪切力（FSS）對BMSCs成骨的影響 本實驗目的是觀察在FSS的作用下，已經礦化誘導的BMSCs的成骨分化效應是否能得到增強。 在不同梯度的FSS作用下，BMSCs堿性磷酸酶活性經ALP活性實驗證明均有不同程度的提高，其中尤以12dyne/cm2作用明顯。更重要的是，以上成骨效應在用ICI182780阻斷雌激素受體后，均有明顯降低，提示了雌激素受體在此過程中也

8、具有一定介導作用。 5．流體剪切力與雌激素雙因素對BMSCs成骨效應的影響 本實驗目的是觀察在FSS和E2雙因素的作用下，已經礦化誘導的BMSCs的成骨分化效應是否得到增強。 利用優(yōu)化的12dyne/cm2 FSS復合10-6M的E2培養(yǎng)，ALP活性和核結合因子-1（Cbfa1）等成骨特征因子卻呈現(xiàn)基因豐度的減低。應用此檢測，Erα的基因豐度在刺激下無明顯變化，提示二者對成骨分化沒能表現(xiàn)出協(xié)同效應。 總