轉錄因子FoxA1對干細胞多能性基因Nanog的轉錄調控研究.pdf

1、胚胎干細胞具有在體外自我更新和分化成所有三胚層來源的細胞的能力。廣義上的胚胎干細胞包括：一.從機體幼稚生殖細胞發(fā)生癌變形成的惡性畸胎瘤建立的胚胎癌細胞（embryonal carcinoma cell，EC細胞）；二.從囊胚的內細胞團建立的胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES細胞）；三.從胚胎性腺區(qū)的原始生殖細胞建立的胚胎生殖細胞（embryonic germ cell，EG細胞）。胚胎干細胞的多能性主要依靠以Oct

2、4，Nanog，Sox2為核心的轉錄因子網(wǎng)絡來維持。
　　本文主要以P19胚胎癌細胞（EC細胞）為模型，研究干細胞在維甲酸（retinoic acid, RA）誘導的分化過程中的基因表達調控機制。P19細胞具有多能性，注射到囊胚期胚胎中能形成嵌合體動物、注射到裸鼠皮下能形成具有三胚層結構的畸胎瘤；在體外，能被誘導分化成胚胎所有三胚層來源的細胞。因此，P19細胞是研究多能干細胞分化調控機制的良好模型。
　　本文著重研究轉錄因子

3、FoxA1在干細胞分化過程中的轉錄調控機制。FoxA1是Forkhead Box轉錄因子家族的一員，參與胚胎發(fā)育中細胞增殖與分化的調節(jié)。由于能夠結合高度壓縮的染色質，并引導其它轉錄因子與染色質的結合，F(xiàn)oxA1被稱為“先鋒”轉錄因子。過去的研究發(fā)現(xiàn)，在RA誘導的P19細胞分化過程中，F(xiàn)oxA1表達迅速被激活；多能性相關基因表達迅速下降，如Nanog；而分化相關基因表達依次被激活，如早期神經發(fā)生相關基因Shh，神經干細胞標志物Nestin

4、。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxA1直接激活了Shh的表達；同時發(fā)現(xiàn)，在P19細胞中單獨過表達FoxA1，可激活Nestin表達，并導致Nanog蛋白水平的下降。本文從表觀遺傳學角度，探索轉錄因子FoxA1在RA誘導的干細胞分化過程中對多能性基因Nanog的轉錄調控，并得到了以下結果：
　　一.檢測了RA誘導前后多能性標志基因Nanog的表達水平及表觀遺傳修飾狀態(tài)的變化。RA處理P19細胞后， Nanog的mRNA及蛋白水平均迅速下調；

5、同時，我們考察了表觀遺傳修飾狀態(tài)包括組蛋白H3乙?；℉3K9ac）修飾、組蛋白H3K4甲基化(H3K4me2)修飾、組蛋白H3K27(H3K27me3)甲基化修飾和DNA甲基化修飾。研究發(fā)現(xiàn)，在未分化狀態(tài)， Nanog基因的組蛋白修飾狀態(tài)表現(xiàn)為H3K9高度乙酰化，H3K4高度甲基化，H3K27低甲基化；RA誘導兩天后，H3K9被去乙酰化，H3K4甲基化程度降低， H3K27高度甲基化。DNA甲基化方面，在未分化的P19細胞中，Nano

6、g啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化；RA處理四天后，Nanog啟動子區(qū)域被高度甲基化。
　　二.發(fā)現(xiàn)在RA誘導過程中，F(xiàn)oxA1和Grg3直接結合于Nanog基因的增強子，并抑制Nanog的表達。根據(jù)過去的研究結果，猜測FoxA1直接抑制Nanog基因的表達。有文獻報道FoxA1可能募集轉錄輔抑制子Grg3，通過mRNA和蛋白水平檢測，發(fā)現(xiàn)，在RA誘導前后的P19細胞中，Grg3保持穩(wěn)定表達。通過染色質免疫沉淀（ChIP）實驗，確認，在RA

7、處理兩天時FoxA1與Grg3同時結合于Nanog基因上游-2kb附近區(qū)域。此外，在RA處理P19細胞時，分別干擾FoxA1和Grg3的表達，發(fā)現(xiàn)RA處理兩天后， Nanog仍然維持表達。
　　三.探索了FoxA1抑制Nanog表達的細節(jié)分子機制。通過凝膠遷移實驗（EMSA）確認FoxA1結合Nanog增強子-2025bp至-2001bp區(qū)域，而Grg3單獨不能結合DNA；通過免疫共沉淀（Co-IP）與免疫熒光共定位實驗，確認了F