人HMGB1 A box及B box cDNA的克隆、表達及功能鑒定.pdf

1、感染、組織損傷、創(chuàng)傷時天然免疫系統(tǒng)被激活，誘發(fā)級聯(lián)炎癥反應，在臨床上極為常見。其發(fā)生的基本過程是：感染性(如細菌、病毒感染等)和非感染性(如創(chuàng)傷、缺氧、失血性休克等)因素導致機體的多種細胞(如單核/巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞等)被激活，釋放一系列致炎細胞因子(如TNF、IL-1、IL-6等)介導炎癥反應，如果不能得到及時控制，便可發(fā)展為全身性炎癥反應綜合征(SIRS)及膿毒癥，嚴重時可導致DIC、多器官功能衰竭乃至死亡。長期以來，人

2、們一直致力于抑制致炎因子活性的研究，于是，針對TNF、IL-1等致炎因子的拮抗劑廣泛用于抗感染的研究，雖然有一定療效，但對于炎癥晚期所引起的SIRS及膿毒癥卻無能為力。其原因在于大多數(shù)致炎因子在發(fā)生炎癥反應的6個小時內即已經(jīng)釋放并達高峰(這些致炎因子被稱為早期炎癥因子)，故針對這些早期炎癥因子的臨床治療窗口期相當窄，稍一延遲其治療效果就會大大降低，甚至根本無效。于是，研究者們致力于尋找晚期致炎因子。最近的研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白B1(h

3、ighmobilitygroupbox-1protein，HMGB1)，一種廣泛存在的、高度保守的細胞核非組蛋白，主要在核內參與核蛋白復合體組成、基因轉錄調節(jié)等。當其釋放至胞外時，可作為晚期致炎因子介導炎癥反應，同時HMGB1本身也能刺激單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等分泌TNF、IL-1、IL-6等致炎細胞因子。大量的報道證實，HMGB1與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關，成為潛在的介導炎癥的中心[1-5]。人HMGB1全長含215個氨基酸殘

4、基，其中有2個約80個氨基酸殘基組成的HMG“box”，分別是Abox(1-85氨基酸)和Bbox(88-162氨基酸)。經(jīng)結構功能分析，HMGB1的致炎活性主要位于Bbox，而Abox卻對HMGB1全長及Bbox誘導細胞分泌致炎因子有一定的拮抗作用[6]。因此，HMGB1有望成為抗炎治療時藥物設計的新靶點[7,8]。基于以上分析，我們進行了人HMGB1Abox及BboxcDNA的克隆，重組表達質粒的構建，重組蛋白的誘導表達、純化及生物

5、學活性的初步鑒定，旨在為進一步研究和開發(fā)新型抗炎治療候選制劑，以及為深入闡明HMGB1的作用機制奠定基礎。 目的：克隆編碼人HMGB1Abox及Bbox氨基酸的cDNA，將其構建于原核表達載體后，利用大腸桿菌誘導表達，并對表達的目的蛋白進行純化，最終獲得具有生物學活性的重組目的蛋白。 材料與方法：1.克隆編碼人HMGB1Abox及Bbox氨基酸的cDNA。自人扁桃體組織提取細胞總RNA，根據(jù)GenBank中編碼人HMGB

6、1Abox及Bbox氨基酸的cDNA，分別設計一對特異引物進行RT-PCR，2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物，觀察并記錄結果。RT-PCR產(chǎn)物連接于pUC19質粒，重組質粒分別命名為pUC19/HMGB1Abox和pUC19/HMGB1Bbox，然后送上海生工公司和大連寶生物公司測序。 2.重組表達質粒的構建。酶切pUC19/HMGB1Abox和pUC19/HMGB1Bbox質粒，將回收的目的片段HMGB1Abox及HMGB1Bb

7、ox分別連接于含有表達運載蛋白DHFR基因的原核表達載體pQE-80L/DHFR，經(jīng)酶切鑒定得到重組原核表達載體pQE-80L/DHFR/HMGB1Abox和pQE-80L/DHFR/HMGB1Bbox。 3.目的蛋白的表達與鑒定。將構建的重組表達質粒pQE-80L/DHFR/HMGB1Abox、pQE-80L/DHFR/HMGB1Bbox及含HMGB1全長基因的另一重組表達質粒pQE-80L/HMGB1(本室構建)，轉化大腸桿

8、菌DH5α，根據(jù)優(yōu)化確定的IPTG誘導濃度、誘導溫度和時間進行誘導表達，并行SDS-PAGE(5％積層膠，15％分離膠)檢測目的蛋白的表達情況。再經(jīng)蛋白質免疫印跡(WesternBlotting)鑒定目的蛋白的表達。 4.目的蛋白的分離純化。收集經(jīng)IPTG誘導后的細菌，鑒定目的蛋白的表達方式。將超聲碎菌離心后的上清過Ni2+-NTA柱純化目的蛋白，純化后的目的蛋白再過多粘菌素B柱以消除目的蛋白中的LPS對實驗的影響。 5

9、.體外生物學活性的初步鑒定。ELISA檢測人外周血單核細胞受目的蛋白刺激后所分泌的TNF-α、IL-6的水平。 結果：1.經(jīng)RT-PCR成功地克隆了編碼人HMGB1Abox及Bbox氨基酸的cDNA，片段長為255bp和225bp。經(jīng)序列比對，與GenBank中報道的已知序列完全一致。 2.重組表達質粒pQE-80L/DHFR/HMGB1Abox和pQE-80L/DHFR/HMGB1Bbox經(jīng)雙酶切后，分別可見大小約為2

10、55bp和225bp的片段。酶切結果表明兩表達質粒構建成功。 3.經(jīng)對誘導表達條件的優(yōu)化和篩選，確定了最佳誘導表達條件為終濃度1mmol/L的IPTG，在37℃誘導表達4h。SDS-PAGE分析可見，表達的目的蛋白和DHFR融合蛋白的大小分別約為36kDa、35kDa、30kDa和26kDa。其中目的蛋白的表達量經(jīng)軟件分析，達到了細菌表達蛋白總量的約40％，主要是以分泌形式表達。經(jīng)WesternBlotting證實，在大小分別約

11、為36kDa、35kDa、30kDa和26kDa的位置有清楚的蛋白條帶。 4.目的蛋白經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后，再經(jīng)多粘菌素B柱有效地去除了LPS，純化的蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，證明目的蛋白得到有效的純化。 5.生物學活性的初步分析顯示，所制備的目的蛋白HMGB1、HMGB1Bbox可有效地刺激人外周血單核細胞分泌致炎因子TNF-α、IL-6；另一目的蛋白HMGB1Abox能有效地抑制HMGB1及HMGB

12、1Bbox誘導人外周血單核細胞分泌致炎因子TNF-α、IL-6，而用于對照的DHFR融合蛋白沒有表現(xiàn)出任何生物學活性。 結論：本實驗利用RT-PCR技術，成功地自人扁桃體組織克隆了編碼人HMGB1Abox及Bbox氨基酸的cDNA，并成功地構建了重組原核表達質粒pQE-80L/DHFR/HMGB1Abox和pQE-80L/DHFR/HMGB1Bbox。將上述質粒及含HMGB1全長基因的另一重組表達質粒pQE-80L/HMGB1分