MicroRNA-138-5p對肺腺癌細胞吉非替尼敏感性的影響.pdf

1、目的：本研究旨在尋找Gefitinib耐藥的相關(guān)miRNA，確定其靶基因，為克服Gefitinib獲得性耐藥提供思路。
　　方法：使用miRNA芯片分析Gefitinib敏感的PC9肺腺癌細胞和誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥的子代PC9GR(gefitinib resistance)細胞之間miRNA表達譜的差異，篩選出異常表達的miRNA。選取差異最顯著的miRNA為主要研究對象。使用實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)驗證miRNA芯片的結(jié)果

2、。miRNA mimics轉(zhuǎn)染高表達miRNA的細胞，miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染低表達細胞，MTS實驗評估細胞對 Gefitinib的敏感性變化。預(yù)測軟件尋找 miRNA的靶基因，使用qRT-PCR、western blot、免疫組化檢測miRNA與其靶基因的表達量在細胞水平和組織水平的關(guān)系。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)證實miRNA與靶基因直接結(jié)合。在miRNA mimics轉(zhuǎn)染高表達miRNA的細胞、miRNA inhib

3、itor轉(zhuǎn)染低表達miRNA的細胞后，使用qRT-PCR和western blot檢測miRNA靶基因mRNA和蛋白質(zhì)量的變化。使用小干擾RNA技術(shù)(siRNA)敲低靶基因的蛋白表達后，使用MTS實驗評估處理后的細胞對Gefitinib敏感性的變化。
　　結(jié)果：同 PC9細胞相比，miR-138-5p在 PC9GR細胞中表達下調(diào)最明顯。qRT-PCR確認miR-138-5p在PC9GR細胞中表達降低。使用miR-138-5p mi

4、mics PC9GR和 H1975細胞后，Gefitinib的敏感性顯著上升。使用 miR-138-5p inhibitor轉(zhuǎn)染PC9細胞后，細胞對Gefitinib的敏感性無顯著變化。TargetScan and miRanda預(yù)測軟件提示GPR124是miR-138-5p的靶基因。qRT-PCR和western blot的結(jié)果提示，在mRNA水平和蛋白水平上，GPR124的表達量在PC9GR細胞中均高于PC9細胞，與 miR-138

5、-5p的表達趨勢相反。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)提示miR-138-5p與GPR124的3’-UTR區(qū)直接結(jié)合。qRT-PCR檢測提示與癌旁組織相比，miR-138-5p在肺腺癌組織中低表達。免疫組化和 qRT-PCR(P<0.05)提示GPR124在肺腺癌組織中高表達。Pearson檢驗提示在組織mRNA水平上，miR-138-5p和GPR124的表達水平呈負性相關(guān)。siRNA敲低GPR124的表達后，PC9GR和H1974細胞對Ge