阻斷腺苷A-,2A-受體對小鼠大腦中動脈缺血-再灌注損傷的保護作用及其機制探討.pdf

1、第三軍醫(yī)大學博士學位論文阻斷腺苷A受體對小鼠大腦中動脈缺血/再灌注損傷的保護作用及其機制探討姓名：桂莉申請學位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)病學指導教師：鄭健20090501第三軍醫(yī)人學博十學位論文放；( 2 ) 減輕局部炎癥反應(yīng)而減輕缺血觸發(fā)的炎性損害。遺憾的是，至今罕有直接證據(jù)證明阻斷腺苷A 2 A 受體后產(chǎn)生的神經(jīng)保護作用與抑制了谷氨酸的過度釋放有關(guān)，更不明確對谷氨酸釋放的影響發(fā)生在缺血期還是再灌注期。也不明確阻斷腺苷A 2 A 受體對局部

2、炎性過程的影響是否減輕缺血性腦損傷。本研究觀察A 2 A R 基因敲除對腦缺血及再灌注誘發(fā)的腦內(nèi)氨基酸遞質(zhì)釋放的影響，以及對腦缺血／再灌注后腦內(nèi)炎性反應(yīng)的調(diào)控及其與腦損傷的關(guān)系，以探討阻斷腺苷A 2 A 受體對缺血性腦損傷的保護作用機制。方法：引進腺苷A 2 A R 基因敲除( A 2 A R g e n e k n o c k o u t ，A 2 A 剛K O ) 雜合子小鼠交配繁殖，P C R 法鑒定A 2 A 剛K o 小鼠和野

3、生型( w i l d —t y p el i I t e r m a t e s ，A 2 A R 刪T ) 小鼠。參照H u a n g 等方法制備大腦中動脈局灶缺血模型( m i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ，M C A o ) 。分別測定A 2 A 剛K O 小鼠與A 2 A R 刪T 小鼠在缺血期與再灌注期神經(jīng)功能缺損程度；甲酚紫染色( C r e s

4、y l v i 0 1 e ts t a i n ，C v s t a i n ) 結(jié)合圖像分析方法測定腦梗死體積，觀察A 2 A R缺失對缺血期及再灌注期腦梗死體積的影響。運用活體微透析技術(shù)動態(tài)收集兩組小鼠在缺血前、缺血中及再灌注后紋狀體區(qū)細胞外液，并結(jié)合改良的高效液相色譜熒光法( h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y —f l u o r e

5、 s c e n c e ，H P L C —F L ) 檢測微透析液中谷氨酸、天冬氨酸、g a m m a —a m i n o b u t y r i c a c i d ( G A B A ) 與甘氨酸濃度。免疫組化與免疫熒光染色技術(shù)觀察腺苷A 2 A R 缺失對缺血／再灌注后梗塞周邊區(qū)小膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞數(shù)量與形態(tài)變化的影響。結(jié)果：1 ．穩(wěn)定地建立了小鼠M C A o 模型，建模成功率為9 0 ％，建模后神經(jīng)功能評分在l 一

6、3 分的小鼠所占比例為9 1 ．1 ％。經(jīng)2 ，3 ，5 ．三苯基氯化四氮唑( 2 ，3 ，5 ．T r i p h e n y l t e t r a z o l i u mC h l o r i d e ，T T C ) 染色或C V 染色證實M C A o 后評分在1 —3 分的小鼠在缺血側(cè)M C A 供血區(qū)腦梗死部位與范圍較固定。2 ．建立了一種穩(wěn)定的能同時測定腦組織細胞外液中多種氨基酸的H P L C ．F L 方法。該方法能

7、在1 8 嘶n 內(nèi)完成樣品檢測，快速、有效地將樣品中谷氨酸、天冬氨酸、G A B A 、甘氨酸等多種氨基酸類物質(zhì)分離，出峰好、重復(fù)性強、精密度高。3 ．腦缺血及再灌注后缺血中心區(qū)細胞外液谷氨酸、天冬氨酸、G A B A 和甘氨酸的水平兩度升高，形成“雙峰”樣過度釋放。4 ．腺苷A 2 A R 缺失抑制腦缺血誘導的氨基酸的釋放。A 2 A R 缺失減輕缺血造成的神經(jīng)功能缺損( 與A 2 A 叭r T 組比較，P < o ．0 1 )