大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷后膜鐵轉運輔助蛋白的表達變化研究及作用探討.pdf

1、第一部分：大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型的建立
　　 腦血管疾病已成為目前人類的第三大重要的死亡原因之一[1]，特別是發(fā)病率、致殘率高，治愈率低，尤其是大面積、基底節(jié)區(qū)腦梗死對人類危害更大，因此對該類疾病的防治顯得非常重要，可為臨床實行超早期治療與康復護理訓練打下基礎。因此就需要能制作出可靠的、能重復使用的、能模擬臨床病理生理變化的動物模型。近年來人們越來越多的使用線栓法制作大鼠局造性缺血性模型，在于它能近于模擬人類大腦中動脈腦缺

2、血病理過程[2]，從而達到科研的目的。人類最為常見的缺血類型就是大腦中動脈梗塞，所以在實驗中動物大腦中動脈栓塞模型應用的也就最多，參照Zealonga線栓法，并加以改進，在實驗中使用聚乙烯醇處理后的兔須作為線栓制作MCAO模型，好處在于處理后線栓遇血發(fā)生膨脹，可使線栓能夠充滿所需要栓塞的血管，使血流完全中斷，進而提高了模型制作的成功率；使用頸總動脈（CCA）及頸外動脈（ECA）兩種不同的進線方法，通過比較神經(jīng)肌肉運動功能評分、前庭功能評

3、分、腦梗死體積等，進而得出兩種制作方法的優(yōu)缺點。
　　 目的：
　　 用兩種進線法建立Wistar大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血模型，比較這兩種方法的優(yōu)劣，以觀察模型的可靠性，為早期診治缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 選取健康清潔級Wistar大鼠70只。具體分組如下：對照組（5只）、假手術組（5只）、頸總動脈（CCA）進線組（30只）和頸外動脈（ECA）進線組（30只），后兩組按照處死時間

4、分6個亞組，即缺血再灌注后4小時、8小時、16小時、32小時、64小時、128小時，6個亞組，每亞組5只大鼠，建立大鼠腦缺血再灌注損傷動物模型。參照Zealonga的線栓法，加以改進，使用兔須替代尼龍線，經(jīng)聚乙烯醇處理后分別由頸總動脈（CCA）和頸外動脈（ECA）進線制作栓塞模型。缺血90分鐘后，向外抽拔線栓實現(xiàn)再灌注，然后在再灌注后4小時、8小時、16小時、32小時、64小時、128小時聯(lián)合應用神經(jīng)肌肉運動功能評分法、前庭運動功能評分

5、法評價大鼠運動功能，3天后處死大鼠，測定大鼠大腦梗塞體積并進行比較兩種方法的優(yōu)缺點。
　　 結果：
　　 頸總動脈進線法和頸外動脈進線法神經(jīng)肌肉功能評分、前庭功能評分、腦梗死體積分別為4.1±0.645和5.1±0.546、2.6±0.576和3.6±0.519、22.9％±4.6％和30.5％±3.5％，兩法比較神經(jīng)肌肉功能評分及前庭功能評分差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；兩法腦梗死體積相比差異亦有統(tǒng)計學意義（p<0

6、.05）。
　　 結論：
　　 兩種方法制作的大鼠腦缺血模型的均出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，腦組織缺血梗死表現(xiàn)。與頸總動脈進線法相比，頸外動脈進線法大鼠神經(jīng)行為學評分高、腦梗死體積大、成功率高，模型穩(wěn)定性好。
　　 第二部分：腦缺血再灌注損傷后膜鐵轉運輔助蛋白的表達與變化研究及作用探討
　　 鐵是生命體內不可缺少的微量元素，同樣又是人體中最豐富的過渡金屬[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)鐵的功能遠比人們想象的重要。鐵在人腦中分布

7、廣泛，但這種分布并不是均勻的。人類神經(jīng)系統(tǒng)的各種細胞中幾乎都有鐵的分布，如神經(jīng)元、少突觸膠質細胞、小膠質細胞和一部分星形膠質細胞都含量較多，其中含鐵量最多的是少突膠質細胞。腦內鐵具有極其重要的作用，維持鐵的穩(wěn)念對機體非常重要，眾多的研究表明急性腦缺血后機體各器官會出現(xiàn)鐵代謝紊亂，鐵負荷過重可介導一系列的病理生理變化，從而誘發(fā)各種疾病。
　　 研究證明，鐵蛋白（transferrin，Tf）和轉鐵蛋白受體（transferrin

8、receptor，T：fR）是參與鐵在腦組織中吸收的兩種途徑的主要蛋白。研究發(fā)現(xiàn)鐵在腦細胞中的代謝機制與外周代謝機制大不相同，且前者代謝及平衡機制更為復雜，已有研究證明，鐵代謝的主要途徑是轉鐵蛋白受體介導的細胞轉鐵蛋白-fe（Tf-fe）參與的途徑，另外新發(fā)現(xiàn)的鐵代謝蛋白如膜鐵轉運蛋白1（Ferroportin1 FP1）、二價金屬轉運體（DMT1）等也參與了腦的鐵代謝過程。膜鐵轉運輔助蛋白（Hephaestin，Hp）是研究性連貧血（

9、sex-linked anemic，sla）小鼠時發(fā)現(xiàn)的一種新的鐵轉運相關蛋白。該蛋白的表達有明顯的組織特異性，其中小腸高度表達。研究表明[4]在小鼠和大鼠的大腦皮層、紋狀體、脈絡叢、海馬、黑質等腦區(qū)也有Hp mRNA和蛋白的豐富表達，最近有報道[5]人類Hp在腸道神經(jīng)系統(tǒng)以及胰腺p細胞也有表達。Hp與銅藍蛋白（Ceruloplasmin，CP）屬同一家族，也是一含銅的亞鐵氧化酶，能將有毒的二價鐵氧化成無毒的三價鐵。到目前為止，已有報道

10、腦缺血后Hephaestin表達的變化，本研究目的是用不同種類的大鼠在不同的缺血再灌注時段觀察Hephaestin的表達變化。
　　 目的：
　　 探討大鼠腦缺血再灌注后Hephaestin在大腦皮層、紋狀體表達的動態(tài)變化與再灌注時間的關系，初步探討Hephaestin在腦鐵代謝中的作用。
　　 方法：
　　 選取40只健康清潔級Wistar大鼠，隨機分為8組，每組5只。第一組（假手術組）僅分離頸總動脈和

11、頸外動脈及頸內動脈，并不進行插線；第二組為對照組，不做任何處理；第三組為缺血/再灌注組，依據(jù)再灌注后4小時、8小時、16小時、32小時、64小時、128小時不同時間點分為六個亞組；建立大鼠腦缺血再灌注損傷動物模型，免疫組化染色，通過Leica Q550IW系統(tǒng)進行圖像分析，計算出損傷后不同時點大鼠大腦皮層、紋狀體區(qū)平均光密度值。
　　 結果：
　　 正常大鼠的大腦皮層、紋狀體都有Hephaestin表達，缺血側大腦皮層、

12、紋狀體再灌注后8小時表達明顯增加并持續(xù)到再灌注后64小時，表達高峰出現(xiàn)在再灌注16至32小時期間（P<0.05），至128小時表達較正常對照組有明顯減少（（P<0.05）。
　　 結論：
　　 大鼠腦組織中Hephaestin的表達在急性腦缺血再灌注后出現(xiàn)明顯的變化，研究表明，在腦缺血再灌注16-32小時后表達最為明顯，128小時后表達程度達到低谷。Hephaestin在急性腦缺血的病理生理變化中可能發(fā)揮著重要的作用，H