真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SA，pVAX1-GC和pVAX1-SG的構(gòu)建及真核表達(dá).pdf

1、齲病是一種細(xì)菌感染性疾病，在人類其主要的致齲菌是變形鏈球菌群(mutans streptococci group)中的變形鏈球菌(S. mutans)和茸毛鏈球菌(S.sobrinus或稱遠(yuǎn)緣鏈球菌)。粘附是變形鏈球菌致齲的首要條件，變形鏈球菌表面蛋白(surface protein antigen，SpaP)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucocyltransferases，GTFs)介導(dǎo)其對(duì)牙面的蔗糖依賴性粘附和蔗糖非依賴性粘附，是菌體表面重

2、要粘附毒力因子，且具有良好的免疫原性和反應(yīng)性，其編碼基因分別為spap、gtf。 本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建含有血清c型變形鏈球菌表面蛋白A區(qū)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化區(qū)CAT編碼基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SA、pVAX1-GC和pVAX1-SG，為下一步用微球包裹口服多價(jià)防齲核酸疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和物質(zhì)條件。 方法：本研究共分為三個(gè)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一將變形鏈球菌表面蛋白A區(qū)編碼基因spap/A克隆到真核表達(dá)載體

3、pVAX1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SA。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析和酶切鑒定；并轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞COS7中以間接ELISA法和SABC法初步檢測(cè)pVAX1-SA的蛋白表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二將變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性區(qū)(CAT)編碼基因gtfB/CAT克隆到真核表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-GC。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析和酶切鑒定；并通過(guò)SABC法初步檢測(cè)其蛋白表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)三在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將兩個(gè)目的基因

4、片段克隆到真核表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SG經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定后，通過(guò)間接ELISA法和SABC法初步檢測(cè)該重組質(zhì)粒能夠正確表達(dá)融合蛋白。 結(jié)果： (1)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAX1-SA測(cè)序分析其閱讀碼框架未發(fā)生改變，經(jīng)HindⅢ/Xho Ⅰ雙酶切后可獲得3.0kb和1.32kb大小的片斷，分別與載體pVAX1與目的基因spap/A的大小一致，證實(shí)pVAX1-SA構(gòu)建成功；間接ELISA法和SABC法

5、初步證明其能正確表達(dá)目的蛋白。 (2)重組質(zhì)粒pVAX1-GC測(cè)序分析其閱讀碼框架未發(fā)生改變，經(jīng)Kpn I/EcoRⅠ雙酶切后可獲得3.0kb和0.53kb大小的片斷，分別與載體pVAX1和目的基因gtfB/CAT的大小相一致，表明pVAX1-GC構(gòu)建成功; SABC法初步證明其蛋白表達(dá)正確。 (3)重組質(zhì)粒pVAX1-SG通過(guò)基因測(cè)序和HindⅢ、BamHⅠ和EcoR Ⅰ限制內(nèi)切酶酶切鑒定證實(shí)融合基因片段插入方向和位置