真核表達質粒pcDNA3-MDC-IFN-γ-VP1的構建及免疫效果研究.pdf

1、目的：柯薩奇病毒B組3型(Coxsackievirus group B type3， CVB3)是引起人類病毒性心肌炎的主要病原體。VP1是CVB3的主要衣殼蛋白，含有幾個T細胞和B細胞表位，免疫原性強，可刺激機體產生保護性的中和抗體。但國內外研究表明，編碼VP1的DNA疫苗免疫小鼠后雖然可誘導機體產生中和抗體，但效價比較低，不能有效阻止致死量CVB3的感染。因此，如何增強VP1基因的免疫原性，提高免疫保護作用是當前倍受關注的問題，也是

2、本室近幾年的研究重點。
　　 本室曾采用DNA疫苗的靶向策略[51，將巨噬細胞源趨化因子(MDC)與VP1基因融合，構建成融合DNA疫苗pcDNA3/MDC-VP1，對致死量的CVB3攻擊的保護率有一定程度的提高，但仍達不到實用程度。本室曾嘗試利用IL-2、IL-18、GM-CSF等細胞因子作為基因佐劑，來提高pcDNA3/MDC-VP1融合DNA疫苗的免疫原性，都有一定的效果，但仍不能有效阻止致死量病毒感染。
　　 I

3、FN-γ是一種能對多種細胞產生上調和誘導MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子作用的細胞因子。MDC對抗原提呈細胞(APC)的趨化作用，更好的發(fā)揮干擾素的免疫增強作用，同時介導VP1進入APC細胞，從而促進抗原加工遞呈。另外MDC對Th2細胞具有趨化作用，這將增加APC和Th2細胞的結合機率，從而增強VP1引起的免疫效應。本研究聯合應用MDC和IFN-γ，構建了真核表達質粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1，通過免疫小鼠后誘導的特異性免疫應答水平和

4、病毒攻擊后免疫保護作用來觀察接種后的免疫效果。
　　 方法：(1)利用本室前期構建的pcDNA3/IFN-γ質粒，用自行設計的IFN-γ特異性引物進行PCR擴增；(2)將擴增產物與pMD18-T載體連接，構建質粒pMD18-T/ IFN-γ，轉化DH5α大腸桿菌，篩選重組子，提取質粒進行酶切鑒定和測序；(3)取酶切的IFN-γ片段與經過同樣酶切的pcDNA3[MDC-VP1載體連接，經過轉化、篩選和酶切鑒定后，構建真核表達重組質

5、粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1，并進行測序；(4)用堿裂解法從轉化的DH5α大腸桿菌中大量提取質粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1和pcDNA3/IFN-γ，用聚乙二醇(PEG)沉淀法進行純化；(5)動物實驗：將6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機分為5組，每組23只；分別為生理鹽水對照組、pcDNA3/VP1對照組、pcDNA3/IFN-γ對照組、pcDNA3/MD

6、C-VP1對照組、pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1組。純化后的質粒以生理鹽水稀釋后，股四頭肌注射免疫小鼠，每次每只接種100ug，每3周免疫一次，共免疫3次；每次免疫后第20天，眼眶靜脈采血，分離血清，用微量中和試驗（固定病毒-稀釋血清法）檢測血清中CVB3特異性中和抗體。第三次免疫后3周，每組3只小鼠取脾臟制備淋巴細胞懸液，采用細胞計數試劑盒(cell counting kit-8， CCK-8)法進行特異性淋巴細胞增殖活性和

7、特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte， CTL)殺傷活性的檢測；另每組20只小鼠用5LD50CVB3進行腹腔注射，觀察并記錄小鼠存活情況至感染后第21天。
　　 結果：(1)用自行設計的IFN-γ特異性引物經PCR擴增出了IFN-γ基因片段，基因片段的長度與預期結果符合。(2)成功構建原核克隆載體pMD18-T/IFN-γ，DNA測序證實目的基因序列與Genbank登錄序列相同。(3)基因序列插

8、入pcDNA3/MDC-VP1后，酶切和測序結果證實成功構建了pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1。(4)各次免疫后血清CVB3VP1特異性IgG水平分別為：pcDNA3/MDC-VP1組1:7.07，1:16.82，1:28.28；pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1組1：7.32，1：18.02，1:29.28;其余組各次平均效價均低于1:5。單因素方差分析表明，三次免疫后以上兩組中和抗體滴度逐次增加，但兩組之間無統(tǒng)計學差異

9、。其他各組間無差異。(5)小鼠脾淋巴細胞增殖活性經單因素方差分析表明，以CVB3刺激時，pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1組高于pcDNA3/MDC-VP1組(P＜0.05);以ConA刺激時，兩組無差異。(6)小鼠脾淋巴細胞特異性CTL殺傷活性經單因素方差分析表明，pcDNA3/IFN-組、pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1組均高于pcDNA3/MDC-VP1組(P＜0.05)。(7)用5LD50CVB3攻擊小鼠，各組平均

10、存活率分別為：生理鹽水對照組10％，pcDNA3/IFN-γ組20％，pcDNA3/VP1組15％,+pcDNA3/MDC-VP1組40％,pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1組35％。
　　 結論：(1)成功構建了原核表達質粒pMD18-T/IFN-γ。(2)成功構建了真核表達質粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1。(3)用致死量CVB3攻擊小鼠后，各組均未能有效的增強小鼠的免疫保護作用，不能預防致死量CVB3感染。