MYBL2基因在結直腸癌的表達及機制的初步探討.pdf

1、結直腸癌是常見的惡性腫瘤，在西方國家，結直腸癌是導致癌癥死亡的第三位腫瘤。我國的飲食習慣正在不斷改變，飲食中纖維素的含量下降將可能提高結直腸癌的發(fā)病率。此外，我國的腫瘤篩查和標準化治療等程序不如西方國家規(guī)范，結直腸癌正在嚴重威脅著人們的健康。然而腫瘤是一個多因素多步驟的發(fā)病機制，迄今為止，多種癌基因及抑癌基因的發(fā)現(xiàn)和提出部分闡明了腫瘤的機制。并且這些研究結果將有望成為今后治療腫瘤的新方向。MYBL2基因，又稱B-MYB，廣泛地表達于增殖

2、的細胞，MYBL2具有多種的作用，首先，它維持正常的細胞周期進程。其次，MYBL2通過多個途徑抑制細胞的凋亡。此外，MYBL2還與細胞衰老相關。有研究表明，MYBL2還與干細胞樣表型有關。MYBL2還可以維持多能干細胞的特性，如維持自我更新性和分化等。MYBL2在多種腫瘤中呈過表達，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，并且MYBL2的表達水平還與腫瘤患者的預后相關。因此，MYBL2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。目前，關于MYBL2在結直腸癌中的

3、研究報道較少，主要缺乏MYBL2在結直腸癌組織中mRNA水平和蛋白水平方面的研究，也沒有建立其與結直腸癌患者預后的關系，此外，在該基因功能學的研究也只是集中在細胞周期相關方面，而MYBL2是否在結直腸癌中還具有其他的相關功能，這也將是本研究需要探討的。本研究分為三個部分：
　　目的：通過RT-PCR的方法檢測結直腸癌組織和正常腸上皮組織的MYBL2mRNA表達情況，研究MYBL2基因在結直腸癌和正常組織的表達差異，并且探究MYBL

4、2基因與結直腸癌患者臨床病理特征以及預后的關系。
　　方法：收集2007年至2009年在復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院組織庫保存的結直腸癌RNA later標本，其中有70對病例用于檢測癌與癌旁組織mRNA表達量，另180例腸癌組織用于研究MYBL2表達量與臨床病理特征和無病生存期(DFS)的關系。正常腸組織與結直腸癌組織mRNA表達差異用配對T檢驗，腸癌組織中mRNA表達量與臨床病例特征之間的關系用T檢驗和方差分析，用Kaplan-Mei

5、er法計算兩組的預后和繪制生存曲線，并用Log rank法進行單因素分析，計算生存曲線之間的差異，通過COX回歸模型進行多因素分析。
　　結論：在癌組織中，MYBL2的mRNA表達量明顯高于正常組織(P=0.016)，這提示了MYBL2基因可能與結直腸癌的發(fā)生有關。MYBL2基因表達量與結直腸癌的腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結轉移等方面相關。腫瘤最大徑＞5cm組的MYBL2mRNA表達量高于＜5cm組的患者(P=0.048)。Ⅲ期患者

6、的表達量高于Ⅱ期患者(P=0.014)。有淋巴結轉移組的表達量高于無淋巴結轉移組(P=0.014)，并且，MYBL2基因的表達量與N的分期呈正相關，N分期越高，表達量越高(P=0.049)。MYBL2和患者的復發(fā)轉移相關，復發(fā)轉移組的MYBL2基因表達量顯著高于無復發(fā)轉移組(P=0.037)。MYBL2基因表達量還與結直腸癌患者的無病生存呈負相關(P=0.017)，即MYBL2的mRNA水平越高，患者的無病生存越差。MYBL2的mRNA

7、表達量是影響結直腸癌DFS的獨立預后因素。
　　第二部分：MYBL2蛋白在結直腸癌和癌旁組織的表達差異以及與臨床病理特征和預后的關系。
　　目的：目前為止MYBL2的蛋白水平在結直腸癌的表達情況未有報道，在組織中，一個基因的mRNA水平和蛋白的表達水平不一定完全一致，因此，在檢測MYBL2的mRNA水平時，檢測其在結直腸癌中的蛋白表達水平也尤為重要。此外，免疫組化的檢測方便可行，更廣泛適用于臨床診斷。在本部分中，我們將用免疫

8、組化的方法進一步研究MYBL2的蛋白在結直腸中的表達情況，探討其蛋白水平在結直腸癌預后是否仍具有顯著意義。
　　方法：收集2005年至2007年在復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院行結直腸癌手術患者石蠟標本，制成組織芯片待檢，其中癌組織標本共97例，為結直腸癌原發(fā)灶，正常腸組織標本104例。蛋白表達量與臨床病理特征之間的關系用卡方檢驗，用Kaplan-Meier法計算和繪制生存曲線，并用Log rank法進行單因素分析，計算生存曲線之間的差異，

9、通過COX回歸模型進行多因素分析。
　　結論：MYBL2蛋白主要表達在細胞漿和細胞核中。結直腸癌組織中的MYBL2蛋白的高表達率遠遠高于正常腸上皮的高表達率。MYBL2蛋白表達與臨床病理特征關系的分析顯示，MYBL2蛋白表達量與患者的性別、年齡、分化程度、大體類型、腫瘤大小、部位和TNM分期無明顯關系。但是，復發(fā)轉移組的高表達率(93.75％)高于無復發(fā)轉移組(70.77％)，并具有統(tǒng)計學意義(P=0.010)。MYBL2蛋白表達

10、與結直腸癌患者預后相關，高表達MYBL2蛋白比低表達者具有更差的DFS(P＜0.05)。通過對結直腸癌預后的COX多因素回歸分析，MYBL2蛋白和腫瘤分期是結直腸癌的獨立預后因子。
　　第三部分：MYBL2基因在結腸癌中機制的初步探討。
　　目的：MYBL2基因可能參與了結直腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展，它可能影響腫瘤的增殖、侵襲或轉移?，F(xiàn)有報道顯示，MYBL2基因在細胞增殖中起著重要的作用，并且還參與細胞周期的調(diào)控。因此，本部分將進

11、一步研究MYBL2基因對結腸癌細胞的增殖、遷移能力的影響，探討其可能的機制。
　　方法：運用RT-PCR法及western blot法檢測各腸癌細胞株中的MYBL2基因和蛋白表達量。選擇高表達的SW480結腸癌細胞株，用siRNA干擾MYBL2的表達。用CCK8法檢測干擾組和對照組間的增殖差異，用流式法檢測細胞周期和細胞凋亡，用劃痕實驗以及transwell小室實驗檢測MYBL2對細胞遷移的影響，最后，用western blot法

12、檢測干擾組和對照組與侵襲、周期、凋亡相關蛋白的變化情況。
　　結論：當MYBL2的siRNA成功干擾結腸癌細胞株SW480后，通過CCK8細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，MYBL2可以促進結腸癌細胞的增殖。通過對細胞周期的研究發(fā)現(xiàn)，干擾MYBL2基因將使細胞停滯在G2期，阻止細胞周期的進程。此外，干擾MYBL2基因的表達將促進細胞的凋亡。這提示了MYBL2可能通過調(diào)控細胞周期和細胞凋亡等機制促進結腸癌的增殖。細胞劃痕和Transwell小室實驗