TH基因修飾骨髓基質(zhì)細胞源神經(jīng)干細胞自體移植治療恒河猴帕金森病模型.pdf

1、目的:該研究采用分子克隆、骨髓源神經(jīng)干細胞培養(yǎng)和腦立體定向細胞移植等實驗技術,將hTH基因分別構建入pEGFP-C2和pcDNA3.1His真核表達載體中,構建了pEGFP-C2-hTH和pcDNA3.1His-hTH.同時,純化提取pEGFP-C2質(zhì)粒,酶切鑒定后分別轉入培養(yǎng)的骨髓源性神經(jīng)干細胞,體外進行其基因表達情況的觀察,證實成功表達后,將轉染的骨髓源性神經(jīng)干細胞定向注射入經(jīng)右頸總動脈注射MPTP制作的偏側恒河猴帕金森病模型的尾狀

2、核頭部和黑質(zhì)部位.移植后定期觀察恒河猴的動作行為變化.5個月后行頭部<'18>F-FDG PET、MRI和<'99m>Tc-TRODAT-1SPECT檢查,分別觀察細胞移植后腦內(nèi)的代謝、結構和腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的分布.最后,免疫組織化學觀察移植細胞的分布情況.結論:該研究采用分子克隆技術成功構建了pEGFP-C2-hTH和pcDNA3.1His-hTH、純化并提取了pEGFP-C2真核表達表達質(zhì)粒.應用Nucleofector<'TM>核

3、轉染技術成功地將His、hTH和EGFP基因轉入體外培養(yǎng)的骨髓源神經(jīng)干細胞.所培養(yǎng)的細胞表達Nestin和CD133抗原,并能分化為神經(jīng)元樣細胞和膠質(zhì)細胞樣細胞,免疫細胞化學檢測可見NSE、GFAP和β-tublin抗原陽性表達.而后應用RT-PCR、免疫細胞化學等技術對基因修飾細胞進行目的基因表達情況的測定,發(fā)現(xiàn)目的基因都有效長期表達.隨后應用腦立體定向細胞移植技術將基因修飾細胞自體移植入偏側恒河猴帕金森病模型的尾狀核頭部和黑質(zhì)部位.

4、通過術后阿撲嗎啡誘導、<'18>F-FDG PET、MRI和<'99m>Tc-TRODAT-1 SPECT檢測發(fā)現(xiàn)細胞移植后對動物的PD行為有所緩解,較模型猴腦內(nèi)代謝有所改善、右側黑質(zhì)-紋狀體區(qū)DA能神經(jīng)元有所增加,移植區(qū)域的結構也有相應改變.細胞移植6個月后免疫組織化學顯示TH免疫反應陽性細胞數(shù)量有相應增加,而且EGFP、His和Brdu標記明確地顯示出移植細胞的分布和遷移情況,能有效地與自身細胞進行區(qū)分,為下一步骨髓源神經(jīng)干細胞自體