骨髓基質細胞移植治療帕金森病的實驗研究.pdf

1、第一章自體骨髓基質細胞腦內移植治療帕金森病的實驗研究 目的：將自體骨髓基質細胞(marrow stromal cells，MSCs)體外擴增后植入帕金森病(Parkinson disease，PD)大鼠的紋狀體內，觀察其在患鼠腦內的生存、分化、遷移等變化，以期為研究和治療PD提供新的思路和新的方法。 方法：將6-羥基多巴(6-OHDA)注入大鼠一側黑質致密部(SNc)和中腦腹側背蓋區(qū)(VTA)內，建立PD樣的動物模型。在

2、PD人鼠脛骨處抽取骨髓后，從骨髓中分離出MSCs進行培養(yǎng)和擴增。在詳細記錄了每只PD大鼠的旋轉次數(shù)后，用5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine，Brdu)標記擴增的MSCs，以細胞濃度為l×10′/ml植入同種同體PD大鼠傷側紋狀體內。于術后7天、14天、21天、30天、60天腹腔注射阿樸嗎啡(Apomorphine，APO)誘導PD大鼠的旋轉行為，觀察PD大鼠的行為學改變；取移植后存活7天、2l天、2個月的PD大鼠的

3、腦組織行Brdu免疫熒光和免疫組織化學單標檢測，觀察移植細胞的生存和遷移情況；行Brdu/膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體和Brdu/神經原纖維(NF)抗體免疫組織化學雙標檢測，觀察 MSCs 是否分化為星形膠質細胞和神經細胞。實驗設立生理鹽水替代細胞對照組和正常大鼠細胞移植對照組。 結果：(1)PD 大鼠模型的建立：PD大鼠模型恒定轉向健側，旋轉次數(shù)>7r/min；H-E染色和TH免疫組化染色顯示發(fā)現(xiàn)病鼠患側SNc和VTA多

4、巴胺能神經元的數(shù)目明顯減少。(2) MSCs的分離、培養(yǎng)和標記：大鼠骨髓的 MSCs體外培養(yǎng)兩周后純化，成梭形，平行排列或漩渦狀生長。經細胞爬片Brdu免疫組化證實85﹪MSCs標記上Brdu。(3)MSCs腦內移植：腦切片 Brdu 免疫熒光加免疫組化染色結果顯示移植初期，移植細胞呈簇狀或串狀沿針道分布，細胞數(shù)量較多，移植細胞向周圍組織遷移，以移植區(qū)域為主。隨著時間的推移，移植細胞逐漸向雙側紋狀體、大腦皮層、海馬、胼胝體、側腦室、第三

5、腦室等處遷移。(4)移植7天后，在許多Brdu<,+>細胞的胞漿中可見到 GFAP 陽性產物，但是未觀察到NF的陽性產物。(5)正常大鼠對照組移植細胞的存活、遷移、分化情況與 PD 組的結果相同，兩組無統(tǒng)計學差異。(6)未移植 PD 模型組、MSCs 移植組、生理鹽水對照組的旋轉實驗顯示，移植前后各組動物的旋轉行為未見明顯改善。(7)所有動物在移植兩個月內未發(fā)現(xiàn)有腫瘤的形成。 結論：在 PD 腦的微環(huán)境中，MSCs能向腦的許多部

6、位進行遷移，并可分化為星形膠質細胞，MSCs用于PD細胞替代治療有很大的可能性。但 MSCs 在 PD 腦的微環(huán)境中是否可以分化為神經細胞進而發(fā)揮功能改善 PD 的癥狀，尚有待于進一步研究。 第二章：大鼠骨髓基質細胞體外誘導分化為神經細胞的實驗研究 目的：觀察大鼠MSCs在維甲酸(Retinoic acid，RA)、RA聯(lián)合膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(Glialcell-derived neurotrophic facto

7、L GDNF)、與神經干細胞(neural stem cells，NSCs)共培養(yǎng)三種誘導條件下體外分化成神經細胞的能力，為其將來可能的臨床應用提供理論和實驗基礎。 方法：在大鼠脛骨處抽取骨髓后，從骨髓中分離出MSCs進行培養(yǎng)和擴增。取原代第五天的MSCs分別進行：A組：0．3ug/ml RA單獨誘導MSCs；B組：0．3u∥ml RA聯(lián)合20n∥ml GDNF誘導MSCs．C組：MSCs與已培養(yǎng)成球的NSCs共培養(yǎng)進行誘導，M

8、SCs共培養(yǎng)之前行Brdu標記。誘導三大后免疫組織化學法檢測各組貼壁細胞GFAP、NF、酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)表面標志的表達，以觀察MSCs的分化情況。 結果：(1)A組MSCs分裂增殖速度明顯低于B組，在誘導24小時后胞體回縮呈錐形，突起延長且數(shù)量增多，有神經元樣形態(tài)，3天后僅有少部分細胞表達神經元特異性標志物NF。(2)B組MSCs亦出現(xiàn)上述形態(tài)學上改變，且細胞間相互連接成網絡狀，多數(shù)

9、細胞表達NF，其中少部分同時表達多巴胺能神經元特異性標志物TH。(3)C組：NSCs球很快解離，迅速貼壁，共培養(yǎng)的貼壁細胞大量增殖且多呈神經元樣，胞體細長多突起，相互間連接成網。多數(shù)貼壁細胞分別單獨表達NF和TH，以及星形膠質細胞特異性標志物GFAP少數(shù)細胞可見Brdu/NF，Brdu/GFAP，Brdu/TH雙標陽性。 結論：MSCs在RA、GDNF、NSCs存在的情況下可定向轉化為神經元，并有向多巴胺能神經元分化的可能。RA