CKAP4在肝癌中的生物學(xué)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，并且死亡率非常高，其原因一方面因?yàn)楦伟┑纳飳W(xué)行為，另一方面因?yàn)槿狈υ缙谠\斷，而已有的AFP在肝癌診斷上只有60％左右的陽性率。如果能找到相對肝癌特異的蛋白或基因，將會(huì)對研究肝癌的發(fā)病機(jī)制以及提高早期診斷有重要的意義。目前研究發(fā)現(xiàn)人類癌抗原(Human Carcinoma Antigen，HCA)作為一種糖蛋白

2、復(fù)合物在癌癥中廣泛表達(dá)，其蛋白成分具有腫瘤相對特異性。尋找特異性的肝癌相關(guān)的HCA分子為提高原發(fā)性肝癌的早期檢出率以及了解HCC的生物學(xué)行為和靶向治療提供了新線索和新依據(jù)。
　　 應(yīng)用免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定出細(xì)胞骨架相關(guān)膜蛋白4(cytoskeleton-associated membrane protein CKAP4)是HCA的一個(gè)組成成分。CKAP4，又稱P63，細(xì)胞骨架相關(guān)膜蛋白4(CKAP4)，分子量63KD，是一種

3、Ⅱ型跨膜蛋白，連接于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與微管之間。其由氨基端106個(gè)氨基酸的細(xì)胞溶質(zhì)尾，跨膜區(qū)以及羧基端474個(gè)氨基酸的細(xì)胞漿區(qū)組成。早期研究表明CKAP4對維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)具有重要的作用。最近被鑒定為組織纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)，表面活性蛋白A(SP-A)，以及抗增生因子(anti-proliferative factor，APF)的細(xì)胞表面受體。其中已有研究表明CKAP4-與APF結(jié)合可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能和Wnt信號(hào)通

4、路相關(guān)。而Wnt信號(hào)通路是眾多組織中調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化的重要通路。因而探討CKAP4在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要的臨床價(jià)值。
　　 目前有關(guān)CKAP4在肝癌細(xì)胞表達(dá)情況以及在肝癌發(fā)生發(fā)展中處于何種地位尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究的目的一方面研究CKAP4在肝癌中的表達(dá)情況并結(jié)合臨床資料探討其表達(dá)與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；另一方面研究CKAP4在肝癌中的生物學(xué)作用及機(jī)制；最后將研究CKAP4血清學(xué)檢測診斷肝癌的應(yīng)用價(jià)值。從而有助于了解

5、肝癌的生物學(xué)行為及為可能的靶向治療和診斷提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.運(yùn)用real-time PCR、western blot以及IHC等方法檢測肝癌、癌旁及正常肝組織中CKAP4的表達(dá)情況；
　　 2.IHC方法檢測大鼠DEN誘癌過程中CKAP4在肝臟中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化過程；
　　 3.結(jié)合臨床資料統(tǒng)計(jì)分析CKAP4與相關(guān)臨床指標(biāo)及預(yù)后之間的關(guān)系；
　　 4.構(gòu)建CKAP4高低表

6、達(dá)的質(zhì)粒并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體、高表達(dá)CKAP4及穩(wěn)定干擾CKAP4的肝癌細(xì)胞系：WRL68-VT、WRL68-OV；7721-VT、7721-OV、7721-KD，用real-time PCR和western blot鑒定高低表達(dá)效果；
　　 5.采用CCK-8檢測CKAP4高低表達(dá)對多種細(xì)胞系增殖的影響；
　　 6.用western blot檢測在TNFα和CHX或DTT刺激下CKAP4高低表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響；

7、>　　 7.CKAP4高低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系經(jīng)EGF刺激后，通過real-time PCR和western blot檢測Wnt信號(hào)通路和EMT相關(guān)的蛋白的變化；
　　 8.擴(kuò)增CKAP4高低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系行裸鼠皮下荷瘤，觀察腫瘤生長情況。并用real-time PCR、western blot以及IHC等方法對腫瘤組織分析；
　　 9.通過ELISA檢測大鼠DEN誘癌過程中血清中CKAP4的動(dòng)態(tài)變化，及比較正常、肝炎、肝硬

8、化及肝癌病人血清中CKAP4的表達(dá)；
　　 結(jié)果
　　 1.CKAP4在肝癌組織中高表達(dá)：
　　 ①基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平顯示CKAP4在肝癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常組織；
　　 ②IHC結(jié)果根據(jù)著色強(qiáng)度和著色面積評(píng)分顯示肝癌組織評(píng)分結(jié)果明顯高于癌旁組織和正常組織的評(píng)分結(jié)果，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以正常組織的著色情況為基準(zhǔn)分為高表達(dá)組(61％)和低表達(dá)組(39％)。
　　 2.在大鼠DEN

9、誘癌過程中，CKAP4在肝臟中的表達(dá)逐漸升高：IHC顯示實(shí)驗(yàn)組隨著時(shí)間延長CKAP4表達(dá)越來越高，在10W時(shí)實(shí)驗(yàn)組明顯高于對照組，而對照組CKAP4表達(dá)無明顯變化。
　　 3.臨床資料統(tǒng)計(jì)分析：
　　 ①卡方檢驗(yàn)顯示CKAP4表達(dá)和腫瘤大小、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門靜脈侵犯、BCLC分期成負(fù)相關(guān)；
　　 ②CKAP4表達(dá)和生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間呈正相關(guān)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.CKAP4高低表達(dá)對肝癌細(xì)胞的影響：

10、
　　 ①CKAP4過表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，干擾掉促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞的凋亡；
　　 ②CKAP4過表達(dá)后抑制細(xì)胞的遷移和克隆形成能力，和對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 5.相關(guān)機(jī)制研究：抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和EMT的發(fā)生
　　 ①在EGF刺激下，和對照組相比CKAP4過表達(dá)可抑制GSK3β、AKT、JNK、ERK的磷酸化能力；在蛋白水平和基因轉(zhuǎn)錄水平抑制β-catenin、c-My

11、c和cyclinD1的表達(dá)。
　　 ②在EGF刺激下，和對照組相比CKAP4過表達(dá)在蛋白水平和基因轉(zhuǎn)錄水平抑制snail、vimentin的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherine、ZO-1的表達(dá)。
　　 6.裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)：
　　 ①皮下腫瘤大小：干擾CKAP4后腫瘤較對照組大，過表達(dá)組腫瘤最小。
　　 ②腫瘤組織分析顯示CKAP4過表達(dá)可抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及抑制EMT的發(fā)生，和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致

12、。
　　 7.CKAP4在肝癌患者血清中的濃度較正常人高：
　　 ①ELISA檢測在大鼠DEN誘癌過程血清中CKAP4濃度變化，結(jié)果顯示從8W開始CKAP4濃度明顯高于正常，到14w時(shí)CKAP4濃度達(dá)到最高，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 ②ELISA結(jié)果顯示肝炎、肝硬化、肝癌病人血清中CKAP4濃度明顯高于正常人，其中肝炎、肝癌與正常相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 結(jié)論
　　 本研究發(fā)現(xiàn)CKAP4在肝癌組織

13、中高表達(dá)，與腫瘤大小、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門脈侵犯及BCLC分期密切相關(guān)。單因素分析CKAP4是OS和DFS的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，多因素分析CKAP4是OS的風(fēng)險(xiǎn)因素，有望作為評(píng)估肝癌預(yù)后的一項(xiàng)有前景的指標(biāo)。進(jìn)一步體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究表明CKAP4在肝癌發(fā)生過程中起抑制作用，其可能通過抑制Wnt信號(hào)通路和EMT的發(fā)生發(fā)揮其生物學(xué)作用。另外，CKAP4在肝癌血清中濃度高于正常，ROC曲線分析CKAP4作為肝癌的診斷指標(biāo)和AFP比較效能偏低，但是在AFP<1