FOXJ1在胃癌惡性生物學表型中的作用和機制.pdf

1、【背景】
　　胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率居高不下。胃癌的發(fā)生受多因素影響,其發(fā)病機制尚有待闡明。盡管早期診斷和新型治療方法不斷出現(xiàn),但是進展期胃癌因生長迅速和高轉(zhuǎn)移率,預后差,5年生存率低于20％。而目前臨床上主要通過TNM分期、腫瘤組織學類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征對胃癌患者進行術前評估和預后判斷的方式敏感性較低,且存在爭議。因此,分析胃癌發(fā)生發(fā)展的相關分子機制,尋找新的胃癌早期診斷分子生物學指標和潛在治療靶

2、點,對改善胃癌預后和提高患者生存率具有重要意義。
　　FOX轉(zhuǎn)錄因子家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子。FOX家族成員在胃癌中發(fā)揮的作用也吸引了眾多研究者。已有研究發(fā)現(xiàn),一方面,FOXC2、FOXM1和FOXQ1在胃癌中表達增高,FOXM1b可以促進血管內(nèi)皮生長因子的活化和誘導胃癌血管的生成,提示其在胃癌中可能發(fā)揮促癌作用。另一方面,FOXD3在幽門螺桿菌感染誘導的超甲基化過程中下調(diào),參與HP感染引發(fā)的胃癌;FO

3、XO3a與RUNX3協(xié)同活化Bim,共同誘導胃癌細胞凋亡,提示FOXD3和FOXO3a可能參與抑制胃癌的發(fā)生。而其他FOX家族成員在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍不清楚。我們實驗組主要研究 FOX家族在胃腸道腫瘤和肝癌中的作用,并已發(fā)現(xiàn),FOXM1和FOXC1可通過促進MMP-7、RhoC和ROCK1的表達或誘導EMT促進肝癌轉(zhuǎn)移;FOXQ1可通過誘導EMT和募集巨噬細胞浸潤發(fā)揮促癌作用并促進轉(zhuǎn)移發(fā)生。
　　FOXJ1作為FOX家族的成員

4、之一,除了在胚胎發(fā)育和分化、纖毛形成、抑制自身免疫反應等生物學行為中起著重要的調(diào)控作用之外,近年來也發(fā)現(xiàn)FOXJ1在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不同的作用:一方面,FOXJ1在乳腺癌和卵巢癌中可能發(fā)揮抑癌作用;另一方面,也有研究報道FOXJ1在肝癌中可能發(fā)揮促癌作用。提示我們,FOXJ1在腫瘤中可能呈異質(zhì)性表達,并在不同的腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮不同作用。而FOXJ1在胃癌中的表達情況、作用機制和臨床價值仍無研究報道。
　　【目的】

5、　　檢測FOXJ1在胃癌組織中的表達變化情況,分析其表達水平與臨床病理學特征以及患者預后之間的關系,探討其潛在的臨床價值;觀察FOXJ1對胃癌惡性生物學表型尤其是轉(zhuǎn)移表型的影響;探討FOXJ1抑制胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制。為闡明FOXJ1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制,以及FOXJ1在胃癌診斷和治療中的潛在價值奠定理論基礎。
　　【方法】
　　1、收集105例胃癌及其相匹配的癌旁組織石蠟標本,定制組織芯片,利用免疫組化染色檢測FOX

6、J1在胃癌組織和相應癌旁組織中的表達情況;收集7例手術切除新鮮冰凍胃癌及癌旁組織標本,利用Real-time PCR和Western blot從mRNA水平和蛋白水平驗證免疫組化結(jié)果;
　　2、根據(jù)免疫組化染色評分結(jié)果,統(tǒng)計分析FOXJ1表達水平與胃癌患者臨床病理學特征之間的相關性;收集105例胃癌患者的隨訪資料,采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,應用log-rank檢驗分析FOXJ1的表達與胃癌患者生存時間之間的關系;

7、應用單因素和多因素COX回歸模型分析影響胃癌患者生存的獨立預后因素;
　　3、購買40例胃癌與配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶芯片,利用免疫組化染色對比分析FOXJ1在發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶和相應淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達水平;
　　4、利用Western blot檢測FOXJ1在各胃癌細胞系和永生化胃黏膜上皮細胞系GES-1中的表達情況;根據(jù)檢測結(jié)果,選取胃癌細胞系AGS、BGC823和永生化胃黏膜上皮細胞GES-1,以及高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系

8、MKN28M/MKN28NM和
　　SGC7901M/SGC7901NM作為后續(xù)研究的細胞模型,利用成功包裝的FOXJ1過表達慢病毒載體(LV-FOXJ1)和相應的對照載體(LV-control),分別感染AGS、BGC823、MKN28M和SGC7901M細胞,利用FOXJ1shRNA慢病毒載體(LV-FOXJ1-shRNA)和相應的對照載體(LV-shRNA-control),分別感染GES-1、MKN28NM和SGC7901

9、NM細胞,經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定感染細胞株AGS-FOXJ1、BGC823-FOXJ1、MKN28M-FOXJ1、SGC7901M-FOXJ1、GES-shFOXJ1、MKN28NM-shFOXJ1、SGC7901NM-shFOXJ1,并利用Real-time PCR和Western blot分別驗證感染的有效性;
　　5、利用MTT實驗觀察改變FOXJ1的表達對AGS、BGC823和GES-1細胞體外增殖能力的影響;

10、　　6、利用裸鼠體內(nèi)成瘤實驗觀察改變FOXJ1的表達對BGC823和GES-1細胞體內(nèi)成瘤能力的影響;
　　7、利用Array Scan VTI1700 plus高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)、劃痕實驗、Transwell遷移和侵襲實驗研究FOXJ1對胃癌細胞的體外運動、遷移和侵襲能力的影響;
　　8、利用裸鼠尾靜脈注射內(nèi)臟轉(zhuǎn)移實驗,結(jié)合活體成像技術,研究FOXJ1對高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系MKN28M/MKN28NM體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響

11、;
　　9、利用Real-time PCR和Western blot從mRNA水平和蛋白水平分別檢測FOXJ1對高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系MKN28M/MKN28NM中MMP-2和MMP-9及其內(nèi)源特異性活性調(diào)節(jié)因子TIMP2和TIMP1表達的影響;
　　10、利用免疫組化染色檢測FOXJ1與β-catenin在胃癌組織中的表達相關性;
　　11、利用免疫熒光染色,檢測過表達或干擾FOXJ1表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細胞亞系MKN2

12、8M-FOXJ1、MKN28NM-shFOXJ1中β-catenin表達部位的變化;
　　12、利用Western blot檢測FOXJ1對高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系MKN28M/MKN28NM中β-catenin和磷酸化β-catenin表達的影響。
　　【結(jié)果】
　　1、FOXJ1在胃癌組織中的表達明顯低于相應的癌旁組織
　　免疫組化染色結(jié)果顯示,FOXJ1在癌旁組織中主要定位于胞核,胞漿中也有表達,而在胃癌組

13、織中FOXJ1主要定位于胞漿,且表達強度明顯減弱。進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),FOXJ1在105例癌旁組織中有99例表達呈陽性,表達陽性率為94.3%,而在105例胃癌組織中僅有51例表達呈陽性,表達陽性率為48.6%。FOXJ1在胃癌組織中的表達明顯低于相應的癌旁組織,具有統(tǒng)計學差異(P<0.001)。利用Real time PCR和Western blot檢測FOXJ1在7例新鮮胃癌組織及對應的癌旁組織中的表達情況,結(jié)果表明:7例胃癌組織中

14、,有6例FOXJ1的表達明顯低于相應癌旁組織,與免疫組化結(jié)果一致。
　　2、FOXJ1的表達水平與胃癌分期和轉(zhuǎn)移密切相關
　　根據(jù)免疫組化評分結(jié)果統(tǒng)計分析提示,FOXJ1的表達水平與胃癌的浸潤深度(P<0.001)、TNM分期(P=0.039)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.003)及遠處轉(zhuǎn)移(P=0.029)密切相關,即TNM分期越高、浸潤深度越深、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移的胃癌病例,FOXJ1的表達越低。
　　3、FOXJ1

15、的表達水平與胃癌患者預后密切相關,并可作為胃癌患者的獨立預后因素
　　Log-rank生存分析結(jié)果提示,與FOXJ1陽性患者相比,FOXJ1陰性患者的生存時間明顯縮短(P=0.037);單因素和多因素COX回歸模型分析提示FOXJ1表達水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移可作為影響胃癌患者生存的獨立預后因素。
　　4、FOXJ1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達水平明顯低于胃癌原發(fā)灶
　　免疫組化結(jié)果顯示,在40例胃癌原發(fā)灶中,

16、FOXJ1主要在胞漿中呈中等強度或弱表達,而在相應淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中僅呈現(xiàn)非特異弱表達;同時FOXJ1陰性表達的患者多傾向于出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,FOXJ1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達明顯低于相應的胃癌原發(fā)灶(P=0.005)。
　　5、FOXJ1在胃癌細胞系中的表達下調(diào)
　　FOXJ1在胃癌細胞系MKN28、MKN45、SGC7901、AGS、BGC823中的表達水平明顯低于永生化胃黏膜上皮細胞系GES-1,而FOXJ1在高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細

17、胞系MKN28M、SGC7901M和GC9811P中的表達也明顯低于相應的低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系MKN28NM、SGC7901NM和GC9811。
　　6、FOXJ1可抑制胃癌細胞的體內(nèi)外增殖能力
　　MTT結(jié)果顯示,上調(diào)FOXJ1的表達可降低AGS和BGC823細胞的體外增殖能力,而下調(diào)FOXJ1的表達可以增強GES-1細胞的體外增殖能力;裸鼠體內(nèi)成瘤實驗顯示,過表達FOXJ1可抑制BGC823細胞的體內(nèi)成瘤能力,而干擾FO

18、XJ1的表達可促進GES-1細胞的體內(nèi)成瘤能力。
　　7、FOXJ1可抑制胃癌細胞的體外運動、遷移和侵襲能力以及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力高內(nèi)涵分析結(jié)果顯示,上調(diào)FOXJ1的表達可減弱高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系的體外運動能力,而下調(diào)FOXJ1的表達則增強低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系的體外運動能力;劃痕實驗以及Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示,上調(diào)FOXJ1的表達可抑制胃癌細胞的遷移和侵襲,而下調(diào)FOXJ1的表達可促進胃癌細胞的遷移和侵襲;裸鼠尾靜脈注

19、射內(nèi)臟轉(zhuǎn)移實驗結(jié)合活體成像分析結(jié)果顯示,過表達FOXJ1的MKN28M-FOXJ1細胞在裸鼠體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移的光學信號強度明顯減弱,且在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移率降低,肝臟表面形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)減少,而下調(diào)表達FOXJ1的MKN28NM-shFOXJ1細胞在裸鼠體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移的光學信號強度顯著增強,且在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移率升高,肝臟表面形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)增加。
　　8、FOXJ1可抑制胃癌細胞系中MMP2和MMP9的表達,并促進胃癌細胞系中TIMP1、TIM

20、P2的表達
　　Real time PCR和Western blot結(jié)果顯示,過表達FOXJ1可以顯著降低高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系MKN28M中MMP2、MMP9的表達,并增強TIMP1、TIMP2的表達,而干擾FOXJ1的表達可明顯增加低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細胞系MKN28NM中MMP2、MMP9的表達,并降低TIMP1、TIMP2的表達。
　　9、FOXJ1可能通過Wnt/β-catenin通路發(fā)揮作用
　　免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),

21、在105例胃癌組織中,有50例胃癌組織呈β-catenin核表達陽性,與FOXJ1共定位統(tǒng)計分析提示,FOXJ1與β-catenin核表達在胃癌組織中呈負相關(相關系數(shù)為-0.228,P=0.003);免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)FOXJ1可使MKN28NM細胞中β-catenin在細胞漿中聚集,并在細胞核內(nèi)出現(xiàn)β-catenin表達;而上調(diào)FOXJ1可減少MKN28M細胞胞漿中β-catenin的聚集,并抑制β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)位

22、;Western blot檢測結(jié)果顯示,FOXJ1對各亞系細胞內(nèi)總β-catenin的影響不大,但是下調(diào)FOXJ1可降低MKN28NM細胞中β-catenin的磷酸化水平,而上調(diào)FOXJ1可增強MKN28M細胞中β-catenin的磷酸化水平。
　　【結(jié)論】
　　1、FOXJ1在胃癌組織中表達減弱,且FOXJ1在胃癌中的下調(diào)與腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關;FOXJ1的表達水平與胃癌患者生存時間呈正相

23、關,并可作為影響胃癌患者生存的獨立預測因素。提示FOXJ1有望作為臨床診斷胃癌的新的分子標志物和治療靶向。
　　2、FOXJ1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達減弱,且FOXJ1陰性表達的患者多傾向于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;體內(nèi)外實驗證實,FOXJ1參與抑制胃癌細胞增殖、侵襲、遷移等多種惡性生物學行為。
　　3、FOXJ1可能通過增強TIMP1、TIMP2的表達抑制胃癌細胞中MMP9和MMP2的活性，減少細胞外基質(zhì)降解；通過抑制β-cateni