HIV新發(fā)-急性感染者不同亞群T細(xì)胞BTLA表達(dá)與疾病進(jìn)展關(guān)系研究.pdf

1、目的:B、T淋巴細(xì)胞衰減因子(BTLA)是繼PD-1、CTLA-4后，免疫球蛋白超家族發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)抑制性分子，作為新近發(fā)現(xiàn)的抑制性受體，日益受到關(guān)注。BTLA表達(dá)于外周血成熟淋巴細(xì)胞，脾臟巨噬細(xì)胞和髓系樹突狀細(xì)胞(DCs)，在NK細(xì)胞上低表達(dá)，行使負(fù)性免疫調(diào)節(jié)功能，其配體為腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)的成員HVEM(HVEM)，兩者結(jié)合屬于跨家族結(jié)合。體外實(shí)驗(yàn)表明BTLA對(duì)T細(xì)胞活化、增殖具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可以抑制CD3誘導(dǎo)的

2、T細(xì)胞增殖以及IL-2，IL-10，IFN-γ的分泌。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，BTLA缺陷小鼠易發(fā)生自身免疫性疾病，小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓膜炎模型中，BTLA缺陷小鼠發(fā)病率高，病情嚴(yán)重，移植排斥反應(yīng)中，BTLA缺陷小鼠比野生型小鼠更易于排斥MHCⅡ不匹配的心臟移植，提示BTLA可以通過對(duì)T細(xì)胞有效的抑制在控制效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。
　　 HIV感染可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)持續(xù)免疫活化及功能耗竭，共抑制分子如PD-1，CTLA-4在HIV感染

3、過程中發(fā)揮著重要作用，這些共信號(hào)分子途徑在T細(xì)胞分化及T細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)功能，從而維持機(jī)體免疫反應(yīng)處于穩(wěn)態(tài)。最近已有研究證實(shí)免疫負(fù)性調(diào)節(jié)分子BTLA在T細(xì)胞免疫耐受中發(fā)揮重要作用，并且影響T細(xì)胞活化和T細(xì)胞功能，與自身免疫性疾病的發(fā)生與疾病進(jìn)程相關(guān)。那么BTLA是否像CTLA-4，PD-1等共抑制分子一樣在HIV感染中發(fā)揮作用?徐向升等人發(fā)現(xiàn)，HIV慢性感染者CD4+、CD8+T細(xì)胞上BTLA表達(dá)隨著疾病進(jìn)展明顯下降。但BTL

4、A在不同亞群T淋巴細(xì)胞表達(dá)，特別是HIV新發(fā)感染者中如何表達(dá)國內(nèi)外尚無報(bào)道。
　　 研究表明，宿主在HIV新發(fā)感染期產(chǎn)生的抗病毒免疫應(yīng)答對(duì)最終的疾病進(jìn)程起了決定性的作用。殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)為限制病毒在體內(nèi)復(fù)制的主要宿主免疫因子，通過作用于病毒感染細(xì)胞，在抗病毒防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用。對(duì)HIV新發(fā)感染期免疫系統(tǒng)與HIV相互作用的研究，對(duì)于了解宿主控制病毒的防御機(jī)制至關(guān)重要。由于HIV新發(fā)/急性感染者樣本較難獲得，目前對(duì)這一

5、時(shí)期的研究較少。本實(shí)驗(yàn)室建立了男男性接觸感染者高危人群隊(duì)列，通過定期隨訪獲得了HIV新發(fā)/急性感染者樣本，本研究首次對(duì)我國HIV新發(fā)/急性感染者不同亞群純真及記憶型T淋巴細(xì)胞BTLA表達(dá)水平與疾病進(jìn)展相關(guān)性進(jìn)行了研究，并與HIV慢性感染者及正常對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，為闡明BTLA在HIV感染中發(fā)揮的作用及免疫治療提供線索。
　　 方法:
　　 1、研究對(duì)象
　　 50例未接受抗病毒治療的HIV感染者來自遼寧、黑龍江、吉林

6、等地，男性46名，女性4名，年齡分布為20-76(33±11.23)歲。其中包括21例HIV新發(fā)/急性感染者（Primary/Acute HIV infection，PHI/AHI組），入選標(biāo)準(zhǔn)為抗體陽轉(zhuǎn)在一年以內(nèi)，檢測時(shí)間為50.10±4.19天；29例慢性HIV感染者（chronic HIV infection，CHI組），HIV感染時(shí)間1年以上；23例健康對(duì)照（normal control，NC組）為隨機(jī)抽取的HIV抗體陰性、未暴

7、露于HIV的健康人，均為男性，符合以下標(biāo)準(zhǔn)：HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無免疫系統(tǒng)疾病。
　　 2、T細(xì)胞亞群BTLA表達(dá)水平及活化水平檢測
　　 取HIV-1感染者全血，應(yīng)用以下熒光標(biāo)記的單抗進(jìn)行染色：CD4-APC-cy7/CD8-Percp/CD3-PE-cy7/ CD45RA-FITC/BTLA-PE;CD4-APC-Cy7/CD8-FITC/CD3-PE-cy7/H

8、LA-DR-Percp/CD38-PE及相應(yīng)同型對(duì)照。樣品于室溫避光染色30min。加入溶血素3毫升，室溫避光，離心，棄上清。加入PBS洗滌，以含1％多聚甲醛的PBS(PBS)重懸，F(xiàn)ACS Aria流式細(xì)胞儀檢測FlowJo軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC、CD3定義T淋巴細(xì)胞，分析CD4+、CD8+、CD45RA+或CD45RA-CD4+、CD8+T細(xì)胞表面BTLA表達(dá)水平。同時(shí)分析CD4+、CD8+T細(xì)胞表面HLA-DR+、CD38

9、+表達(dá)水平。
　　 3、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值及病毒載量檢測
　　 T細(xì)胞絕對(duì)值檢測采用單平臺(tái)法，應(yīng)用BD公司TruCOUNT管，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測，MULTISET軟件分析結(jié)果。病毒載量采用RT-PCR方法，用美國Roche公司的COBAS AMPLICOR自動(dòng)載量儀測定病毒載量。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用Mann-Whitney U t

10、est進(jìn)行組間T細(xì)胞亞群BTLA表達(dá)水平的比較。T細(xì)胞亞群BTLA表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、病毒載量、淋巴細(xì)胞活化水平的相關(guān)性應(yīng)用Spearman相關(guān)進(jìn)行計(jì)算。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、HIV新發(fā)/急性感染者T細(xì)胞亞群BTLA表達(dá)水平
　　 1、 HIV新發(fā)/急性感染組各亞群T細(xì)胞BTLA表達(dá)水平高于正常對(duì)照，其中memory CD4+、memory CD8+、總CD4+T細(xì)胞BTL

11、A表達(dá)水平在兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、 HIV新發(fā)/急性感染組各亞群T細(xì)胞BTLA表達(dá)水平高于慢性感染者，除memory CD8+T細(xì)胞外，其它亞群T細(xì)胞BTLA表達(dá)水平在兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 二、HIV感染者不同亞群T細(xì)胞BTLA表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞活化水平相關(guān)性HIV感染者各亞群T細(xì)胞BTLA表達(dá)水平與T細(xì)胞活化水平負(fù)相關(guān)
　　 1、各亞群T細(xì)胞BTLA表達(dá)百分率與T細(xì)胞活化(CD4

12、+HLA-DR+T細(xì)胞表達(dá))水平明顯負(fù)相關(guān)；
　　 2、na(i)ve CD8+T細(xì)胞BTLA表達(dá)水平與CD4+CD38+T細(xì)胞表達(dá)明顯負(fù)相關(guān);
　　 3、na(i)ve CD4+、naive CD8+、總CD4+T細(xì)胞BTLA表達(dá)水平與CD8+HLA-DR+T細(xì)胞表達(dá)明顯負(fù)相關(guān)。
　　 三、HIV感染者不同亞群T細(xì)胞BTLA表達(dá)水平與CD4、病毒載量相關(guān)性
　　 HIV感染者na(i)ve CD8+、m