中國(guó)HIV-1感染者KIR及HLA-Bw4基因與疾病進(jìn)展關(guān)系的研究.pdf

1、目的: 國(guó)外研究顯示KIR及HLA基因是影響HIV感染后疾病進(jìn)程的重要因素。KIR是NK細(xì)胞表面一類(lèi)重要的識(shí)別受體，在NK細(xì)胞識(shí)別“自己”與“非己”及殺傷功能的調(diào)節(jié)中起著極其重要的作用，其配體為HLA-I類(lèi)分子。KIR及HLA基因復(fù)合體都具有高度的多態(tài)性。國(guó)外對(duì)不同人群KIR基因多態(tài)性與HIV的易感性、HIV感染后疾病進(jìn)展的相關(guān)性研究結(jié)果不盡相同。有研究發(fā)現(xiàn)活化性基因KIR3DS1與HLA-Bw4-80Ile聯(lián)合表達(dá)與延緩疾病進(jìn)

2、展相關(guān)；另有研究顯示聯(lián)合表達(dá)抑制性基因KIR3DL1和HLA-B*57(包括HLA-Bw4-80Ile)有顯著的保護(hù)作用；還有研究發(fā)現(xiàn)HLA-Bw4純合子與延緩疾病進(jìn)展和維持正常水平的CD4+T細(xì)胞顯著相關(guān)。中國(guó)人群的遺傳背景不同于國(guó)外人群，KIR基因多態(tài)性與HIV感染疾病進(jìn)展的相關(guān)性研究目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。本研究選取中國(guó)有償采供血途徑感染HIV-1(B’亞型)者，進(jìn)行KIR和HLA-Bw4基因多態(tài)性的研究，并比較了不同疾病進(jìn)展階段的HI

3、V-1感染者各型KIR和HLA-Bw4基因頻率的差異，以明確其與HIV感染疾病進(jìn)展的關(guān)系，為艾滋病防治提供新的思路。 材料和方法: 1、研究對(duì)象 收集我國(guó)河南省、吉林省及遼寧省HIV-1血清抗體陽(yáng)性者81例，所有病例均為漢族，傳播途徑為有償采供血途徑，感染毒株為HIV-1B’亞型。其中男45例，女36例，年齡10-65歲(平均42歲)。取靜脈血5ml EDTA抗凝，-80℃保存?zhèn)溆?。所有?biāo)本均經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第

4、一醫(yī)院艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室Western blot實(shí)驗(yàn)確認(rèn)為陽(yáng)性。其中緩慢進(jìn)展者(Slow progressors，SP)組43例，入選標(biāo)準(zhǔn)為感染HIV的時(shí)間≥10年，未經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，連續(xù)三次(時(shí)間間隔為6個(gè)月)CD4+T 細(xì)胞測(cè)定均在500/μl以上。典型進(jìn)展者(Typical progressors，TP)組38例，入選標(biāo)準(zhǔn)為感染時(shí)間>5年，入選本研究時(shí)均未經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，CD4+T細(xì)胞<500/μl和/或出現(xiàn)艾滋病指

5、征性疾病。所有入選對(duì)象在抽血留樣前均簽署知情同意書(shū)并進(jìn)行了相關(guān)問(wèn)卷調(diào)查。 2、DNA提取 使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取全基因組DNA。標(biāo)本為1ml EDTA抗凝外周靜脈血，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)方法快速提取全基因組DNA。 3、CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù) 將20μl CD4/CD8/CD3 TRITEST試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，加入50μl抗凝血，室溫避光15分鐘，加入免洗溶血素

6、450μl，室溫避光15分鐘，上機(jī)，F(xiàn)ACSMULTISET 軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析，計(jì)算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及相應(yīng)比值等。 4、KIR等位基因分型檢測(cè) KIR分型采用PCR-SSP方法，使用KIR Genotyping SSP Kit檢測(cè)。根據(jù)產(chǎn)物有無(wú)及片段的大小，對(duì)照工作表確定KIR基因型。 5、HLA-B基因分型檢測(cè) 采用PCR-SSP方法，以全基因組DNA為模板，以Bx1和

7、BINT3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用QIAquick Gel Extraction Kit純化擴(kuò)增的1000bp左右的HLA-B基因片段。以BEX2F為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。 6、HLA-B核苷酸及氨基酸序列特征分析 使用BioEdit軟件包中CLUSTAL W程序，對(duì)我國(guó)HIV-1感染者的HLA-B基因序列與參考株序列進(jìn)行排列和比較。用Translation程序?qū)⒑塑账嵝蛄蟹g成氨基酸序列，根據(jù)HLA-B基因第二外顯子C-

8、末端80-83位所編碼氨基酸序列的差異，判斷其血清型。 7、統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，基因出現(xiàn)頻率通過(guò)直接計(jì)數(shù)測(cè)得，比較組間差異進(jìn)行x2檢驗(yàn)并計(jì)算P值?；蚺c疾病進(jìn)程相關(guān)程度用比值比(Odds ratio，OR)計(jì)算。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、與HIV-1感染者疾病進(jìn)程相關(guān)的KIR位點(diǎn)等位基因 TP組和SP組的KIR2DS3等位基因頻率分別為26.3％和7.0％，TP組明顯高于SP組，

9、兩組的KIR2DS3等位基因頻率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.018，OR=4.762，95％CI=1.201-18.883)。 2、與HIV-1感染者疾病進(jìn)程相關(guān)的HLA-B位點(diǎn)等位基因 TP組和SP組的HLA-Bw4純合子基因頻率分別為7.9％和30.2％，TP組明顯低于SP組，兩組的HLA-Bw4純合子基因頻率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.012，OR=0.198，95％CI--0.051-0.761)。 3、KIR3