全人源抗c-Met Fab抗體的篩選及鑒定.pdf

1、c-Met是由原癌基因Met編碼的酪氨酸激酶受體，位于細胞膜上，包含1個50kDa的α亞基和1個150kDa的β亞基，兩者經(jīng)二硫鍵連接形成異二聚體。c-Met是肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor/scatter factor，HGF/SF)在體內(nèi)的唯一受體，兩者結(jié)合并隨之激活后可促進腫瘤細胞的增殖、遷徙和新血管生成，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前HGF/SF和c-Met多種拮抗劑的研究已在體外和動物實驗

2、中證明可有效地抑制腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，HGF/SF-c-Met已經(jīng)成為腫瘤診斷和生物治療的新靶點。鼠源抗HGF/SF和c-Met單克隆抗體和或/多克隆抗體已在體外和動物實驗中顯示出高親和力和中和活性，但是鼠源性單克隆抗體引起的人抗鼠抗體反應(yīng)(humarn antimouse antibody，HAMA)限制了鼠源抗體在臨床中的應(yīng)用。這就推動了人源化單克隆抗體的研究。與鼠源性單克隆抗體相比，人源化單克隆抗體免疫源性明顯減弱，并且血清半

3、衰期顯著延長，促進了單克隆抗體在臨床中的應(yīng)用。本文利用固相篩選方法從大容量人源天然Fab抗體庫中篩選抗c-Met Fab抗體，并對其與人肝癌細胞的結(jié)合活性進行鑒定，為研制用于肝癌生物治療的靶向藥物，提供候選分子。 　　材料與方法　　1.以Met-Fc融合蛋白包板，擴增本實驗室制備的大容量人源天然Fab抗體庫(庫容為1.2×109)。將噬菌體抗體加入Met-Fc包被的ELISA板，進行6輪洗脫、富集，從第6輪篩選后得到的細菌集落中

4、隨機挑取60個克隆，分別用Met-Fc、IgG包板，用Phage ELISA方法鑒定它們的免疫學(xué)特性。 　2.可溶性表達：用符合條件(Met-Fc(+)、IgG(-))的細菌克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Top 10F’，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達抗c-Met Fab抗體。誘導(dǎo)表達上清通過Protein L親和層析法純化。 　3.用Western blotting、IP、FACS、免疫熒光等方法鑒定抗c-Met Fab抗體與c-Met表達陽性細胞

5、表面c-Met分子的結(jié)合活性。 結(jié)果： 1.用Met(c-28)兔抗Met多克隆抗體鑒定SMMC7721、BEL7402兩株肝癌細胞，結(jié)果顯示c-Met均表達于肝癌細胞表面。 2.經(jīng)過6輪Met-Fc固相篩選的噬菌體感染XL I-Blue大腸桿菌，隨機挑取60個克隆表達，進行Phage ELISA鑒定。其中54個克隆與Met-Fc呈陽性反應(yīng)，陽性率為90％。54個克隆中與Fc呈陰性反應(yīng)者有4個克隆(AM1-1

6、4、AM2-9、AM2-18、AM2-26)，BstOI酶切鑒定顯示為同一克隆，測序結(jié)果顯示為人Fab片段。 3.陽性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)表達上清經(jīng)Protein L親和層析純化得到抗c-Met Fab抗體，　經(jīng)SDS-PAGE電泳，在相對分子量26、34kDa處各出現(xiàn)一條條帶，經(jīng)Westem blotting檢測為人Fab片段。 4.IP、FACS、免疫熒光結(jié)果顯示AM2-26可與SMMC7721、BEL740