核受體相關(guān)因子1基因轉(zhuǎn)染骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向多巴胺能神經(jīng)元分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　觀察核受體相關(guān)因子1(Nurr1)基因轉(zhuǎn)染骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的作用，擬探討提高神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的比例。
　　方法:
　　1.通過全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞免疫表型。
　　2.取P4～6生長良好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)液改為無血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM/F12+20μg/L bFGF+20μg/L EG

2、F+2％B27)，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化，采用免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)鑒定。
　　3.采用脂質(zhì)體法將pcDNA3.1-hygro-Nurr1轉(zhuǎn)染骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞，RT-PCR觀察Nurr1基因的表達(dá)情況，并進(jìn)行G418篩選。
　　4.將骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞分為4組進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn):其中將未轉(zhuǎn)染的骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞隨機(jī)分為對照組，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組;將篩選出的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽性的神經(jīng)干細(xì)胞分為核受體相關(guān)因子1組和核受體相

3、關(guān)因子1+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組，分化培養(yǎng)后，免疫熒光法和RT-PCR檢測酪氨酸羥化酶的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.通過貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，5代后細(xì)胞呈均一梭形漩渦樣生長，高表達(dá)CD90及CD29，幾乎不表達(dá)CD45及CD34。
　　2.在無血清培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出的骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞均表達(dá)Nestin抗原，流式細(xì)胞儀檢測P4神經(jīng)干細(xì)胞，Nestin陽性率達(dá)到(96.7±2.1)％。
　　3.RT

4、-PCR顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞4d后核受體相關(guān)因子1高表達(dá)，分化結(jié)果顯示:核受體相關(guān)因子1+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組細(xì)胞內(nèi)酪氨酸羥化酶在mRNA水平上的表達(dá)量最高，神經(jīng)干細(xì)胞貼壁分化后各組的酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞比例均明顯高于對照組，其中以核受體相關(guān)因子1+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子組分化比例最高，為(52.44±15.9)％。
　　結(jié)論:
　　1.利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法可迅速高效地分離和純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并在無血清神