鐵過載催化的氧化應(yīng)激對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 探討鐵過載催化的氧化應(yīng)激——活性氧物質(zhì)(ROS)生成對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)及臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)的細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、支持造血細(xì)胞集落形成能力的影響及其作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.體外培養(yǎng)BM-MSC及UC-MSC，向培養(yǎng)液內(nèi)加入枸櫞酸鐵銨(FAC)建立體外鐵過載模型，并通過檢測細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池(LIP)的水平驗(yàn)證該模型是否成功。
　　 2.

2、分別采用群體倍增時(shí)間(DT)檢測鐵過載BM-MSC、UC-MSC的細(xì)胞增殖能力，碘化丙啶(PI)染色方法檢測細(xì)胞周期，AnnexinV-PI雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡率，用共培養(yǎng)方法檢測MSC的造血支持能力。
　　 3.采用2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針法檢測鐵過載前后細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并進(jìn)一步通過Western blot檢測ROS相關(guān)信號(hào)因子磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(P-p38MAPK)、p38MAPK、蛋

3、白激酶B(AKT)、p53蛋白的表達(dá)情況，并應(yīng)用鐵鰲合劑去鐵胺(DFO)，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)后檢測相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.用貼壁法培養(yǎng)BM-MSC，三代后細(xì)胞形態(tài)均一一致，呈成纖維漩渦狀貼壁生長，且純度較高。當(dāng)給予400μmol/L FAC處理BM-MSC24h后，加鐵組BM-MSC的LIP水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。用400μmol/L的FAC分別處理BM-MSC12、24

4、、48h，細(xì)胞倍增時(shí)間(DT)分別為（35.28±2.64），（43.20±3.12），(48.96±3.36)h，均明顯長于對(duì)照組（28.80±1.25）h，同時(shí)加鐵組BM-MSC的凋亡率（3.51±1.17）％也明顯高于對(duì)照組（0.66±0.62）％（均P＜0.05）。
　　 2.相比對(duì)照組而言，加鐵組BM-MSC細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯高于對(duì)照組，且ROS的水平隨著FAC濃度的增加而增加，在400μmol/L濃度下達(dá)到最高(P

5、＜0.05)。通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路檢測發(fā)現(xiàn)，加鐵組BM-MSCP-p38MAPK、p38MAPK、p53蛋白的表達(dá)明顯增高，而AKT的表達(dá)無明顯差異。
　　 3.當(dāng)給予400μmol/L的FAC處理UC-MSC12h后，加鐵組的LIP明顯高于對(duì)照組，同時(shí)加鐵組細(xì)胞的群體倍增時(shí)間亦明顯長于對(duì)照組(P＜0.05)，但傳代次數(shù)增加2代后兩組之間無明顯差異（P＞0.05）;加鐵組UC-MSC出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯，且

6、其凋亡率(12.75±0.32％)明顯高于對(duì)照組（3.63±0.80％）(P＜0.05);加鐵組UC-MSC與臍血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)分別共培養(yǎng)一周和二周時(shí)，其支持MNC形成造血集落的能力均明顯低于對(duì)照組。
　　 4.加鐵組UC-MSC內(nèi)ROS水平明顯高于對(duì)照組，且ROS的水平呈時(shí)間與濃度依賴性，在400μmol/L FAC濃度下作用12h達(dá)到最高值;且通過檢測ROS相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，加鐵組UC-MSC的P-p38MAPK、p

7、53蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，當(dāng)給予DFO、NAC處理后，UC-MSC細(xì)胞內(nèi)ROS水平及其相關(guān)信號(hào)通路可被抑制。
　　 結(jié)論:
　　 1.鐵過載可抑制BM-MSC及UC-MSC的增殖能力、引起細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，損傷其造血支持作用。
　　 2.鐵過載對(duì)MSC的損傷作用可能與升高的ROS水平，及相繼激活的P-p38MAPK、p53細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，且該途徑可被DFO或NAC部分逆轉(zhuǎn)。
　　 因此，