刺五加多糖對人小細胞肺癌H446細胞的抑制作用及免疫調節(jié)作用研究.pdf

1、目的：最近幾十年，來源于高等植物、藻類、地衣及大型真菌的植物多糖，因其廣譜治病性、低毒且副作用小的特點已經引起生物醫(yī)學界極大的關注。植物多糖已經成為理想的免疫調節(jié)和抗腫瘤新藥的候選。從眾多的植物多糖中篩選出抗腫瘤和免疫調節(jié)作用好的多糖是目前醫(yī)藥學界重要的任務之一。 刺五加(Acanthopanax senticosus Harms)，又名五加參、刺拐棒，屬于五加科，是一種珍貴藥用植物，作為一種傳統(tǒng)的中藥，很久以前就用于治療許多種

2、疾病，如腦血管病、糖尿病、腫瘤、心血管病、高血壓、風濕性關節(jié)炎等，也用于減緩壓力和疲勞。刺五加中含有多種有效成分如甙類、苷類、三萜類、黃酮、多糖、維生素和礦質元素等，這些成分有不同的生物學活性。 刺五加多糖(ASPS)是從刺五加的根及莖皮中提取出的生物活性多糖，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降血糖和降血脂、抗衰老等作用。實驗證明ASPS可以增加淋巴細胞的增殖、促進巨噬細胞的吞噬?？梢燥@著抑制S180的生長、延長荷瘤鼠的存

3、活時間，但是對其抗腫痛、免疫調節(jié)作用的機制還不清楚。 本研究首先用ASPS與經過實驗證明具有抗腫瘤作用和免疫調節(jié)作用的植物多糖，即來自高等植物的黃芪多糖(APS)來自大型真菌的靈芝多糖(GLP)和滑菇多糖(PNP)，通過MTT法等，對白血病細胞株K562的抑制作用及對小鼠體外脾淋巴細胞轉化作用進行比較研究。在此基礎上選取了不同來源的腫瘤細胞株即K562、H446、SMMC-7721、BGC、HeLa細胞株，選出ASPS抑制作用最

4、強的細胞株。然后采用MTT、流式細胞技術、Hoechst33258染色、Western印跡、免疫熒光細胞化學方法、RT-PCR等方法進一步從細胞水平、分子水平研究ASPS對腫瘤細胞凋亡及其相關基因表達的影響，對細胞周期阻滯及相關的細胞信號通路的影響，對腹腔巨噬細胞的體外激活作用及細胞因子產生的影響。為ASPS的開發(fā)利用提供理論基礎。 材料與方法： 1.四種植物多糖的抗腫瘤及免疫調節(jié)作用比較 四種植物多糖由河北師范

5、大學生命科學學院生化與分子生物學實驗室提供。BALB/c小鼠由河北醫(yī)科大學動物中心提供。 1.1 細胞培養(yǎng) K562、H446、SMMC-7721、BGC、HeLa細胞采用含有10％新生牛血清、青霉素100 u/mL、鏈霉素100μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基。置于37℃，5％CO2，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。 1.2 mTT檢測抑制率取對數生長期的細胞，以1×105/mL細胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL

6、，24h后加入100μL用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的四種多糖，終濃度為25、50、100、200、400μg/mL。對照組加等量的無血清培養(yǎng)基。每種藥物濃度均做8個復孔，在分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加MTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心(2000轉/分)，10min，棄去上清，每孔加二甲基亞楓150mL，震蕩10min，用酶標儀測490 nm的A值。根據下列公式計算抑制率：抑制率=[(對照組A-實驗組A)/對照組A×10

7、0％，并根據以上結果用82798-IC50軟件計算出四種多糖作用的半數抑制濃度(IC50)。 1.3 生長曲線的繪制取對數生長期的細胞，以8×104/mL細胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入1mL，24h后加入1mL用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的多糖，終濃度為50，100，200，400μg/mL；對照組加等量的無血清培養(yǎng)基。每種多糖濃度均做4個平行孔。在培養(yǎng)至24、48、72、96、120h后，用血細胞計數器計算每毫

8、升溶液中細胞的數目，繪制生長曲線。 1.4 脾淋巴細胞制備處死小鼠，無菌切取小鼠脾臟，研磨器輕輕研磨，200目不銹鋼網過濾，制成脾細胞懸液。用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，Hanks液洗滌2次，RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，調整細胞濃度為6×106/mL。 1.5 多糖對脾淋巴細胞轉化的影響96孔培養(yǎng)板中每孔加入100μL脾細胞懸液，再加入100μL不同濃度的多糖樣品。每一樣品均設有加ConA(終濃度為5 g/mL)的

9、實驗組與不加ConA對照組，同時設不加樣品的陰性對照組。每組設8孔重復，置37℃，5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結束前4h，每孔加入20μLmTT(2mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入DMSO 150μL裂解細胞后，用酶聯免疫檢測儀于490 nm波長下測定A值，計算刺激指數，SI=實驗組A/對照組A。 1.6 ASPS對不同腫瘤細胞株的抑制作用的比較研究采用MTT法。 2. ASPS誘導人小細胞肺癌H446細

10、胞凋亡 2.1 ASPS對H446細胞增殖的抑制作用，采用MTT法。 2.2 Hoechst 33258熒光染色觀察細胞凋亡取對數生長期的細胞，以1×105個/mL細胞濃度接種于24孔板中，每孔瓶加入1 mL。24 h后加入1 mL用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的ASPS，終濃度為240、480、960μg/mL。對照組加1 mL無血清培養(yǎng)基。每組均做3個復孔，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，用PBS(pH 7.

11、2)漂洗2次，多聚甲醛室溫固定30 min，蒸餾水洗3次。Hoechst 33258(5 mg/L)染色。30 min后蒸餾水漂洗除去染液，熒光顯微鏡觀察照相。 2.3 流式細胞技術(FCM)檢測細胞凋亡率EDTA消化收集細胞，冷PBS洗3次，70％乙醇固定細胞24 h，上機測定前離心去乙醇，用PBS洗兩次，加100μg/mL RNase 37℃消化30 min。50 μg/mL碘化丙錠(propidium iodide，PI)

12、染色30 min，經尼龍網過濾后，用FACSTARCalibur型流式細胞儀測定。實驗結果經計算機軟件ModFit LT2.0處理，計算凋亡率。 2.4 western印跡分析檢測ASPS對p53、bcl-2、bax基因表達水平的影響提取細胞全蛋白，用考馬斯亮蘭G250試劑盒測定蛋白濃度。每梳孔加150 μg樣品蛋白。采用SDS-PAGE不連續(xù)變性蛋白質電泳，電泳至溴酚藍到達分離膠的底部，參照標準分子量蛋白質，截取相應位置的凝膠

13、轉膜，封閉后結合一抗，4℃過夜，漂洗后與辣根過氧化物酶標記的二抗結合，化學發(fā)光顯色，將X光膠片掃描后，采用UVP-Lab work 4.60分析軟件分析條帶光密度。并分析結果。以目標基因與β-肌動蛋白基因產物的吸光度比值計算表達水平。 2.5 免疫熒光細胞化學方法檢測ASPS對p53、bcl-2、bax基因表達的影響細胞處理同2.2，終止培養(yǎng)后，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗3次，細胞載片4％的多聚甲醛30 min。0.3％Triton

14、X-100孵育1次20 min，PBS清洗標本3次各5 min，用3％H2O2去離子水室溫孵育5 min，蒸餾水沖洗，按免疫熒光試劑盒說明進行免疫染色，溶性封片劑(PBS：甘油=1:1)封片。熒光顯微鏡觀察。 3. p-38、ERK通路在ASPS誘導人小細胞肺癌H446細胞G2/M期阻滯中的作用 3.1 流式細胞技術(FCM)檢測細胞周期分布。方法同2.3。 3.2 western印跡分析檢測ASPS對ERK、p

15、-ERK、p38、p-P38蛋白的影響方法同2.4。 3.3免疫熒光細胞化學方法檢測ASPS對p-ERK、p-P38蛋白的影響方法同2.5。 4. ASPS的免疫調節(jié)作用 4.1 巨噬細胞的收集和培養(yǎng): 實驗前3天，給小鼠腹腔注射1mL可溶性淀粉，處死小鼠，腹腔內注射PBS液5 mL，輕揉腹部，在腹膜中央剪一小口，用吸管抽出灌洗液。1000r/min離心10min，用Hanks液離心洗滌細胞兩次，RPMI-164

16、0重懸細胞，調整細胞濃度為106/mL，種在96孔板中，37℃、 5％CO2培養(yǎng)2～4h，棄上清，用37℃預溫的PBS洗滌2次，洗去未貼壁的細胞，貼壁的為腹腔巨噬細胞。 4.2 細胞活力檢測采用中性紅法檢測細胞活力。ASPS處理48h的腹腔巨噬細胞，PBS洗滌，加入新鮮配制的中性紅50ng/mL工作液，在37℃、濃度5％CO2條件下，培養(yǎng)3h。棄去上清液，用PBS洗滌一遍，加入萃取液(乙醇：水：醋酸=50:49:1)，酶標儀檢測

17、540nm的吸光值?；盍τ嬎愎饺缦拢杭毎盍?[加藥孔(A)/對照孔(A)]×100％。 結論： 1. 四種植物多糖對K562細胞的增殖都具有抑制作用，ASPS的抑制作用高于APS、GLP和PNP。 2. ASPS、GLP、PNP能誘導對小鼠體外脾淋巴細胞的增殖，ASPS、PNP誘導作用較強。三種多糖對小鼠體外脾淋巴細胞增殖的誘導與ConA之間沒有協同作用。 3. ASPS對K562、H446細胞增殖的