刺五加多糖對(duì)K562白血病細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、目的： 白血病(Leukemia)是一類造血干細(xì)胞的克隆性疾病，其克隆中的白血病細(xì)胞失去正常的成熟分化能力而停止在細(xì)胞發(fā)育的不同階段；并在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增生聚集，浸潤(rùn)其他組織器官，使正常造血功能受到抑制。在惡性腫瘤死亡率中，白血病居第6位(男)和第8位(女)，在兒童中則居第一位。急性粒細(xì)胞性白血病是成人白血病細(xì)胞的最常見類型，應(yīng)用當(dāng)代的治療方法大部分急粒可以完全緩解，但復(fù)發(fā)率較高。慢性粒細(xì)胞性白血病的死亡率在

2、東方國(guó)家特別是中國(guó)要高于西方國(guó)家，其慢性期一般約為3-4年，應(yīng)用當(dāng)代的治療方法仍有許多患者進(jìn)入急性變期。因此，找到治療白血病的有效藥物和臨床治療的有效方法是一項(xiàng)長(zhǎng)期艱巨的任務(wù)。 中藥刺五加為五加科植物(Acanthopanaxsenticos)的根和根莖，屬滋補(bǔ)性中藥。對(duì)刺五加具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、提高機(jī)體適應(yīng)性和耐受性、抗衰老等藥理作用。最近由文獻(xiàn)報(bào)道刺五加多糖(Acathopanassenticosus polysaccha

3、rides．ASPS)具有抗腫瘤作用，包括調(diào)控腫瘤細(xì)生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡、降低腫瘤細(xì)胞侵襲能力等，其主要通過(guò)提高機(jī)體免疫力和對(duì)腫瘤細(xì)胞直接的細(xì)胞毒作用來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用的。但至今對(duì)其分子機(jī)制仍缺乏了解。 本文主要檢測(cè)不同濃度刺五加多糖對(duì)k562細(xì)胞周期及凋亡率的影響，并檢測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)，如P21，Bax及Bcl-2的變化，從而探討刺五加多糖抑制k562細(xì)胞的有關(guān)分子機(jī)制。 方法： 1 細(xì)胞培養(yǎng)：將K562細(xì)胞用RP

4、MI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，內(nèi)含10％新生牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100μg/ml，置37℃，飽和濕度，5％CO<,2>環(huán)境下培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。 2 MTT法檢測(cè)半數(shù)抑制率(IC<,50>)：分別測(cè)定不同濃度刺五加多糖對(duì)K562細(xì)胞48小時(shí)的抑制率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加到96孔板，參照刺五加多糖的血漿峰濃度分組，加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的藥物，培養(yǎng)48小時(shí)后，加入MTT。4．小時(shí)后棄去培養(yǎng)基加二甲

5、基亞砜，在490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值。根據(jù)吸光度A值計(jì)算細(xì)胞存活率(survival rate，SR)，計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率(％)=用藥組A值/對(duì)照組A值×100％。根據(jù)各藥物SR，由藥物濃度的對(duì)數(shù)值與SR線性回歸求出K562細(xì)胞的藥物半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)。 3 熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)改變：分別收集細(xì)胞，采用不同濃度的刺五加多糖作用K562細(xì)胞48h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。將細(xì)胞用PBS洗后重懸，加入Hochest 3

6、3258熒光試劑0.5ml，吹打混勻，滴至載玻片上，蓋上蓋玻片。置熒光顯微鏡高倍鏡下計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。 4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞加入采用不同濃度的刺五加多糖作用K562細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，70％乙醇4℃固定細(xì)胞24 h，50μg/ml PI染色30 min。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，計(jì)算細(xì)胞周期分布及細(xì)胞增殖指數(shù)，檢測(cè)凋亡率并檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax，Bcl-2蛋白的表達(dá)。 5

7、RT-PCR檢測(cè)p21、CyclinD1、Bcl-2、Bax、的表達(dá)：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物法以M-MLV合成cDNA，以特異的引物擴(kuò)增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳后Goldview染色，圖像分析系統(tǒng)分析擴(kuò)增條帶光密度值，以β-action為內(nèi)參，計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。 結(jié)果： 1 半數(shù)抑制濃度測(cè)定：k562細(xì)胞IC<,50>值為170μg/ml。 2 Hochest染色觀察加藥后細(xì)胞凋亡時(shí)

8、核形態(tài)變化：細(xì)胞凋亡后核固縮、染色質(zhì)固縮集聚、呈塊或碎裂狀改變。 3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果：加藥K562細(xì)胞主要表現(xiàn)為G<,0>/G<,1>期細(xì)胞增多、G<,2>/M期細(xì)胞減少，說(shuō)明加藥后的K562細(xì)胞較加藥前K562細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)；凋亡相關(guān)基因Bax蛋白的表達(dá)增高，Bcl-2蛋白的表達(dá)下降。 4 RT-PCR檢測(cè)p21、CyclinD1、Bax、Bcl-2的表達(dá)：結(jié)果可見p21、CyclinD1、Bax