烏苯美司對(duì)腎癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究烏苯美司對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和OS-RC-2體外生長(zhǎng)的影響，初步研究其對(duì)腎癌細(xì)胞作用的機(jī)制。
　　方法：1.以腎癌細(xì)胞株786-0及OS-RC-2為研究對(duì)象研究烏苯美司對(duì)腎癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響:WST-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制檢測(cè)烏苯美司對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞及OS-RC-2細(xì)胞增殖能力的影響;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察烏苯美司對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞及OS-RC-2細(xì)胞遷移能力的影響;Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)

2、驗(yàn)觀察烏苯美司對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞及OS-RC-2細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　2.烏苯美司對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0和OS-RC-2作用機(jī)制的初步研究:L-亮氨酸-P硝基苯胺底物法檢測(cè)烏苯美司對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞及OS-RC-2細(xì)胞氨肽酶活性的影響。Western Blot檢測(cè)烏苯美司作用于腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞及OS-RC-2細(xì)胞后，兩種細(xì)胞CD13、LC-3、Caspase-3的表達(dá)水平。以不同濃度的烏苯美司、自噬誘導(dǎo)

3、劑rapamycin、自噬抑制劑3-Methyladenine作用于腎癌細(xì)胞株786-0和OS-RC-2，LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)作用后細(xì)胞的死亡率。
　　3.以腎癌患者手術(shù)取得病理組織為研究對(duì)象:Western Blot檢測(cè)氨肽酶N/CD13和LC-3在腎癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)量;以腎癌患者及腎良性病變患者手術(shù)取得病理組織構(gòu)建腎臟病變的組織芯片，通過(guò)免疫組化染色觀察烏苯美司的作用靶點(diǎn)氨肽酶N/CD13在腎癌組織及正常組織中的表達(dá)情

4、況。
　　結(jié)果：WST-8細(xì)胞增殖檢測(cè)及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示經(jīng)0.1mg/ml烏苯美司作用后，腎癌細(xì)胞株786-0及OS-RC-2增殖均受到明顯抑制(P＜0.05)，且隨著藥物濃度的增加，這種抑制作用也逐漸增強(qiáng)（P＜0.05）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0.5mg/ml烏苯美司作用12小時(shí)對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0及OS-RC-2細(xì)胞的遷移有明顯的抑制作用(P＜0.05)，且隨著烏苯美司藥物濃度增加，抑制作用也隨之增強(qiáng)(P＜0.05)。Tran

5、swell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示0.5mg/ml烏苯美司作用24小時(shí)能明顯抑制786-0及OS-RC-2細(xì)胞的侵襲(P＜0.05)。氨肽酶活性檢測(cè)試驗(yàn)證實(shí)經(jīng)0.25mg/ml烏苯美司作用24小時(shí)后，腎癌細(xì)胞株786-0及OS-RC-2細(xì)胞的氨肽酶活性都明顯降低活性(P＜0.05)。Western Blot結(jié)果顯示最高濃度為0.5mg/ml烏苯美司作用于腎癌細(xì)胞株786-0及OS-RC-2后，并沒(méi)有降低兩種細(xì)胞氨肽酶N/CD13蛋白的表達(dá)量

6、(P＞0.05);兩種腎癌細(xì)胞株的自噬相關(guān)蛋白LC-3B表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)，且這種效應(yīng)可被自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin增強(qiáng)或被自噬抑制劑3-MA阻斷(P＜0.05)。對(duì)手術(shù)病理組織的Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示氨肽酶N/CD13和LC-3在腎癌組織及癌旁正常組織中均有表達(dá)，且2種蛋白在癌旁正常組織中的表達(dá)量均明顯高于癌組織（P＜0.05）。腎臟組織芯片免疫組化染色顯示氨肽酶N/CD13在各種病理類型的腎臟病變中均有表