白藜蘆醇影響血管平滑肌細胞成骨樣轉化的研究.pdf

1、目的:研究白藜蘆醇(Resveratrol，Res)對血管鈣化的抑制作用，觀察不同濃度的Res對高鈣、高磷誘導的人血管平滑肌細胞(hVSMC)成骨樣轉化的影響。為終末期腎病(ESRD)患者血管鈣化的預防提供一定的依據(jù)。
　　方法:1.無菌條件下取胎兒（男嬰，足月）臍帶，剝離臍動脈，無菌PBS清洗，剝除外膜，胰酶消化法提取臍動脈平滑肌細胞，體外培養(yǎng)人臍動脈血管平滑肌細胞，通過形態(tài)學和α-SMA標記進行平滑肌細胞鑒定。根據(jù)培養(yǎng)液中含鈣

2、磷濃度分為陰性對照組(NC)及實驗組(PC)，實驗組根據(jù)白藜蘆醇的濃度分為實驗組1(T1，5μ mol/L Res)、實驗組2（T2，10μ mol/LRes）、實驗組3(T3，20μ mol/L Res)。各組培養(yǎng)12天，2-3天換液1次。
　　2.用含高鈣、高磷（Ca2+:2.5mmol/L，P:3.0mmol/L）的培養(yǎng)基誘導平滑肌細胞的成骨樣轉化，通過茜紅素染色法于形態(tài)學上鑒定平滑肌細胞的成骨樣轉化。培養(yǎng)12天后，采用偶氮

3、胂Ⅲ檢測各組細胞鈣含量，對平滑肌細胞的鈣化進行定量檢測。實時熒光定量PCR檢測各組hVSMC成骨樣轉化相關基因BAP、BMP2、OPN的表達水平，Western blot和免疫熒光標記方法檢測各組BMP2、OPN的表達水平。
　　3.統(tǒng)計學分析:采用SPSS18.0對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用(x)±s表示，符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)，組間資料比較采用t檢驗或單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統(tǒng)計學分析， P

4、＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1.原代細胞鑒定:倒置顯微鏡下平滑肌細胞呈長梭形或多邊形，細胞生長呈“峰-谷樣”。免疫組化α-SMA染色見細胞胞漿內(nèi)α-SMA表達豐富，高倍鏡下呈細絲狀。
　　2.與陰性對照組比較，高鈣、高磷組的細胞層見顆粒樣沉積，茜紅素染色見橘紅色團塊狀沉積，鈣含量檢測顯示實驗組鈣含量明顯增加，達5倍(P＜0.05)，其α-SMA蛋白質表達下降，而成骨樣細胞特異性標記BAP、BMP2、OPN mRNA和

5、蛋白質表達均顯著升高(P＜0.05)。平滑肌細胞鈣化模型成功建立。
　　3.不同濃度Res干預后，與高鈣、高磷組比較，T1、T2、T3組細胞內(nèi)鈣含量下降， BAP、 BMP2、 OPN mRNA水平降低;BMP2及OPN的蛋白質表達顯著降低，并與Res濃度呈負相關。
　　4.免疫熒光檢測結果同樣證實:與對照組比較，實驗組OPN、BMP2的表達升高，與Res干預后，隨Res濃度升高，OPN、BMP2的表達逐漸下降。