樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞系的殺傷活性研究.pdf

1、目的；樹突狀細(xì)胞(Dendriticcell，DC)是已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcells，APCs)，不僅可以激發(fā)特異性免疫應(yīng)答，引起相應(yīng)的特異性殺傷效應(yīng)，而且，還可以促進(jìn)非特異性的細(xì)胞毒殺傷。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-inducedkillercells，CIKs)是在多種細(xì)胞因子(IL-2、IL-1、IFN-γ、抗CD3單克隆抗體等)作用下，由外周血、骨髓或臍血中分離出的單個(gè)

2、核細(xì)胞，培養(yǎng)而獲得的一種具有細(xì)胞毒作用的免疫活性細(xì)胞，其抗腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制是非MHC(主要組織相容性復(fù)合體)限制性殺傷。有資料表明DC和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)之后，可以促進(jìn)DC的成熟，分泌大量IL-12，同時(shí)CIK細(xì)胞也可以獲得大量增殖、分泌大量IFN-γ、明顯增強(qiáng)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。有趣的是，DC對(duì)T細(xì)胞刺激時(shí)，也可以分泌大量IL-12，激活的T細(xì)胞也會(huì)分泌大量的IFN-γ；在CIK細(xì)胞中，CD3+CD56+細(xì)胞作為發(fā)揮非特異殺傷的主要細(xì)

3、胞，僅占CIK細(xì)胞總數(shù)的35.5％，而CD3+CD56細(xì)胞占總數(shù)的58％，其中大部分被證明是CD8+細(xì)胞；同時(shí)在CIK細(xì)胞培養(yǎng)初期，可以檢測(cè)到CD45RA表型，該表型是幼稚T細(xì)胞(naiveTcell)表面標(biāo)志，隨著CIK細(xì)胞成熟，該表型明顯下降。上述資料均表明，在CIK細(xì)胞中有可能存在一定數(shù)量的T細(xì)胞，那么這部分T細(xì)胞能否對(duì)表達(dá)特異性抗原的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷呢?為進(jìn)一步驗(yàn)證上述想法，本實(shí)驗(yàn)特采用表達(dá)P-gp特異性抗原的乳腺癌細(xì)胞M

4、CF-7/ADR進(jìn)行凍融抗原，進(jìn)而沖擊DC，然后與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其針對(duì)表達(dá)P-gp抗原的MCF-7/ADR細(xì)胞的特異性殺傷。 方法；采集健康人骨髓分離獲得單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)，分別培養(yǎng)得到DC和CIK。部分DC接受人類乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR細(xì)胞的凍融物抗原沖擊。實(shí)驗(yàn)分組為：1)實(shí)驗(yàn)組：抗原沖擊DC與CIK共育；2)DC對(duì)照組：DC和CIK細(xì)胞共育；3)空白對(duì)照組：CIK細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)15天。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)

5、各組細(xì)胞進(jìn)行DC表型、CIK表型測(cè)定，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定DC、CIK分泌IL-12、IFN-γ水平，MTT法測(cè)定三組細(xì)胞對(duì)表達(dá)P-gp抗原的MCF-7/ADR耐藥株和敏感株細(xì)胞MCF-7的殺傷效應(yīng)。 結(jié)果；試驗(yàn)組、DC對(duì)照組分別與它們各自共培養(yǎng)前比較，其成熟表型均明顯高于培養(yǎng)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003、P=0.001)。CIK細(xì)胞表型(CD3、CD8、CD56)檢測(cè)：三組間均具有表型差異(分別為實(shí)驗(yàn)組

6、：DC對(duì)照組P=0.003，實(shí)驗(yàn)組：空白對(duì)照組P=0.011，DC對(duì)照組：空白對(duì)照組P=0.039)；空白對(duì)照組與CIK單獨(dú)培養(yǎng)第7天的表型比較也有顯著性差異(P=0.014)。此外，在所測(cè)CIK表型中，CD3+CD56+細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)組明顯高于兩對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)組：DC對(duì)照組P=0.001，實(shí)驗(yàn)組：空白對(duì)照組P＜0.001)；CD3+CD8+細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)組也高于DC對(duì)照組和空白對(duì)照組(P=0.002，P=0.002)；CD45RA同樣在實(shí)驗(yàn)

7、組與兩對(duì)照組(DC對(duì)照組、空白對(duì)照組)有顯著性差異，但其在實(shí)驗(yàn)組中是表達(dá)最低的(實(shí)驗(yàn)組：DC對(duì)照組P＜0.001，實(shí)驗(yàn)組：空白對(duì)照組P=0.004)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明：IL-12、IFN-γ水平在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)最高，分別為254±14.5pg/ml、3100±286pg/ml。針對(duì)有耐藥抗原表達(dá)的MCF-7/ADR細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組殺傷效應(yīng)最強(qiáng)，其次為DC對(duì)照組，空白對(duì)照組最弱，三組間均具有顯著性差異(實(shí)驗(yàn)組：DC對(duì)照組P=0.039，實(shí)驗(yàn)

8、組：空白對(duì)照組P=0.002，DC對(duì)照組：空白對(duì)照組P=0.049)；而對(duì)于無P-gp抗原表達(dá)的MCF-7細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組和DC對(duì)照組之間無明顯差異，但均高于空白對(duì)照組，差異有顯著性(實(shí)驗(yàn)組：空白對(duì)照組P=0.007，DC對(duì)照組：空白對(duì)照組P=0.048)。 結(jié)論；我們成功地從人骨髓培養(yǎng)得到DC和CIK細(xì)胞，二者共培養(yǎng)后，能促進(jìn)各自特征性表面標(biāo)志表達(dá)上調(diào)，并分泌大量相關(guān)細(xì)胞因子，觀察到了細(xì)胞殺傷效應(yīng)的明顯提高及可能的特異性