細菌內(nèi)毒素脂多糖對人蛻膜基質(zhì)細胞單核細胞趨化蛋白-1表達影響的研究.pdf

1、從免疫學角度講，妊娠相當于成功的半同種異體移植，妊娠建立與維持取決于胚胎植入及發(fā)育過程中母體蛻膜局部乃至全身免疫系統(tǒng)的狀態(tài)。母體與胎兒之間維持著精妙的免疫平衡，一方面耐受胎兒使其得以植入并在宮內(nèi)正常發(fā)育，另一方面適度活化抵抗病原體侵襲，以免感染后蛻膜局部免疫系統(tǒng)發(fā)生變化，打破母胎間的免疫平衡，使母體排斥胎兒，進而引起流產(chǎn)、胎兒畸形、胎兒宮內(nèi)生長受限、子癇前期子癇等病理妊娠的發(fā)生。母胎之間的免疫平衡有賴于多種免疫細胞和細胞因子的協(xié)調(diào)作用，

2、研究發(fā)現(xiàn)單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)具有抗感染及介導耐受的雙向作用，妊娠早期蛻膜基質(zhì)細胞高表達MCP-1及其受體CCR2，多種炎性因子可刺激蛻膜基質(zhì)細胞(DSC)分泌MCP-1，提示其在感染過程中蛻膜局部免疫平衡的維持方面具有重要作用，因此推測感染可影響其在DSC的表達。目前尚無DSC培養(yǎng)的公認方法，為建立一種科學的DSC體外培證明本實驗結(jié)果的可靠性，本實驗同時進行了DSC體外培養(yǎng)的方法學探討。
　　 目的：
　　

3、 觀察體外模擬早孕微環(huán)境（雌激素、孕激素）條件下革蘭氏陰性細菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)對人蛻膜基質(zhì)細胞MCP-1表達的影響，同時探討蛻膜基質(zhì)細胞體外培養(yǎng)時傳代純化法對該表達的影響。
　　 方法：
　　 選取正常妊娠婦女人工流產(chǎn)蛻膜組織（6-8周），按常規(guī)方法分離蛻膜基質(zhì)細胞，在含有或不含有雌激素、孕激素培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，普通光鏡下分別觀察第一代(P1)與第三代細胞(P3)的形態(tài)；采用免疫細胞化學法（細胞角蛋白7和波形蛋白）

4、分別鑒定兩代細胞的純度，采用流式細胞技術(shù)檢測兩代細胞表面Toll樣受體-4(TLR4)、CCR2分子的表達水平；當細胞鋪板率為80％時，將第一代細胞和第三代細胞分別分為空白對照組、LPS（1μg/mL）刺激組。另外，細胞分別在含與不含雌激素+孕激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代三次后各分為空白對照組、LPS刺激組。37℃、5％CO2培養(yǎng)24h后收集上清，Trizol裂解后按常規(guī)方法提取總RNA，用RT-PCR與實時定量PCR技術(shù)檢測MCP-1轉(zhuǎn)錄水

5、平的表達，ELISA法檢測上清中MCP-1的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、DSC體外培養(yǎng)的方法學探討：
　　 ①與傳代一次的細胞相比，傳代三次的細胞形態(tài)變規(guī)則，細胞突起減少，胞漿內(nèi)顆粒明顯減少，透明度增加，極性減弱或者消失。
　　 ②免疫細胞化學染色顯示，傳代三次細胞較傳代一次細胞DSC純度增加(P<0.05)。
　　 ③流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與傳代一次細胞相比，傳代三次細胞表面TLR4、CC

6、R2分子表達下調(diào)(P<0.05)。
　　 2、LPS對DSC MCP-1表達水平的影響：
　　 ①RT-PCR、ELISA顯示，，傳代一次細胞LPS刺激前即高表達MCP-1，刺激后變化無統(tǒng)計學差異（P0.05）；與傳代一次細胞空白對照組相比，傳代三次細胞空白對照組MCP-1表達水平顯著降低(P<0.05)，但經(jīng)LPS刺激后，其LPS刺激組較對照組顯著上調(diào)(P<0.05)；傳代三次細胞LPS刺激組MCP-1表達水平與傳代一

7、次細胞LPS刺激組無明顯差異（P0.05）。
　　 ②RT-PCR、實時定量PCR、ELISA顯示，與空白對照組相比，傳代三次細胞LPS刺激組、雌激素+孕激素處理組、雌激素+孕激素+LPS處理組在轉(zhuǎn)錄水平與分泌水平上MCP-1的表達顯著上調(diào)(P<0.05)：與雌激素+孕激素處理組和單純LPS刺激組相比，雌激素+孕激素+LPS處理組MCP-1表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、傳代可純化分離

8、培養(yǎng)的DSC，但也使其胞膜表面分子TLR4、CCR2表達水平下降。
　　 2、LPS通過與DSC表面TLR4作用，直接或間接地在轉(zhuǎn)錄水平與分泌水平上調(diào)DSC的MCP-1表達，影響蛻膜局部免疫狀態(tài)。
　　 3、雌、孕激素聯(lián)合作用可上調(diào)早孕期DSC MCP-1的表達，提示MCP-1可能對于正常妊娠的發(fā)生和維持具有不可忽視的作用。
　　 4、雌、孕激素聯(lián)合作用還可增強LPS對MCP-1的上調(diào)作用，說明MCP-1在妊娠早