異丙酚影響脂多糖誘導人單核細胞作用的機制研究.pdf

1、研究背景： 異丙酚(propofol)又名得普利麻，化學名稱2,6二異丙基苯酚，是一種惰性的酚類衍生物，具有起效快、時效短、蘇醒迅速、蘇醒后意識清晰等優(yōu)點，已廣泛用于膿毒癥、嚴重創(chuàng)傷等重危病人及ICU有監(jiān)測條件下的麻醉和鎮(zhèn)靜。近年有大量研究表明異丙酚可有效抑制創(chuàng)傷、手術等過程中的炎癥反應，其控制LPS引起的炎癥反應作用也越來越引起關注。但異丙酚控制LPS引起的炎癥反應的保護機制尚不清楚，目前認為大概有以下幾個方面參與了這一過程：

2、 1、異丙酚抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生； 2、異丙酚能夠清除氧自由基，具有抗氧化作用； 3、異丙酚能夠抑制一氧化氮(nitricoxide，NO)的產(chǎn)生。 蛋白質(zhì)組學研究技術主要包括四個方面： (1)蛋白質(zhì)分離技術； (2)蛋白質(zhì)鑒定技術： (3)蛋白質(zhì)相互作用的研究技術； (4)生物信息技術。 研究目的： 1，觀察異丙酚對LPS誘導THP1細胞釋放細胞因子的變

3、化。 2，研究異丙酚影響LPS刺激THP1細胞作用的蛋白質(zhì)表達譜的變化。 研究方法： 1，異丙酚對LPS誘導THP1細胞釋放細胞因子的變化：將體外培養(yǎng)的THP1細胞分為對照組，1μg/mlLPS刺激組，1μg/mlLPS加50μmol/L屏丙酚組，用LiquiChip液相蛋白片系統(tǒng)檢測三組處理因素作用THP1細胞12h時對分泌粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素1β(I

4、L-1β)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響。并用不同濃度的異丙酚(0，12.5，25，50，100μmol/L)同1μg/mlLPS聯(lián)合刺激培養(yǎng)好的THP1細胞，以未加任何刺激的THP1細胞為對照，分析異丙酚對THP1細胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α影響的劑量效應。 2，異丙酚影響LPS刺激THP1細胞作用的蛋白質(zhì)表達譜的變化 (1)將體外培養(yǎng)好的

5、THP1細胞分為空白對照組，1μg/mlLPS刺激組，1μg/mlLPS加50μmol/L異丙酚組。刺激12h后，1000rpm離心10min，棄上清，將細胞沉淀置液氮中凍存，供下一步蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳檢測用。 (2)將上述THP1細胞進行總蛋白質(zhì)提取，雙向電泳(2-DE)，利用UMAXPowerLook1100透射掃描儀獲取圖像，用PDQwest7.1.0軟件包進行圖像分析，分析包括蛋白質(zhì)斑點的檢測、量化、背景去除和點的匹配，

6、找出三組圖譜中的差異蛋白質(zhì)點。 (3)將差異蛋白質(zhì)點進行膠內(nèi)酶切與MALDI-TOF質(zhì)譜分析。 (4)對所得的肽質(zhì)量指紋圖譜進行數(shù)據(jù)庫分析，明確蛋白質(zhì)的類型及性質(zhì)。 (5)應用WesternBlot對數(shù)據(jù)庫檢索出的部分蛋白進行驗證。 (6)查詢文獻分析篩選獲得的差異表達蛋白質(zhì)功能，結合上述與這些蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)的分析，選擇功能上具有聯(lián)系的蛋白質(zhì)，運用String數(shù)據(jù)庫及其軟件進行相互作用分析，預測是否

7、有蛋白質(zhì)作用對存在。 結果： 1，異丙酚對LPS誘導THP1細胞釋放細胞因子的影響 (1)LPS誘導THP1細胞釋放細胞因子以及異丙酚對其的影響：與對照組相比，LPS組IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α明顯增高(P<0.01)；而GM-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-1β、IL-2、IL-4的變化無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與LPS組相比，LPS加50μmol/L異丙酚組THP1細胞

8、釋放IL-6、IL-8和TNF-α明顯降低(均P<0.01)。 (2)異丙酚對LPS誘導THP1細胞釋放IL-6、IL-8和TNF-α的量效關系：結果發(fā)現(xiàn)異丙酚濃度為12.5μmol/L時就顯示出對LPS誘導IL-6、IL-8和TNF-α釋放的抑制效應，分別從刺激后的266±78pg/ml、1552±279pg/ml、1787±388pg/ml減少到201±67pg/ml(P<0.01)、1364±157pg/ml(P<0.05

9、)、1203±265pg/ml(P<0.01)，隨著異丙酚劑量的增加，三者的釋放進一步顯著減少，至異丙酚濃度為100μmol/L時三種細胞因子的濃度分別是34±12pg/ml、627±135pg/ml、203±72pg/ml，已基本接近正常對照組水平(P>0.05)。將異丙酚濃度與IL-6、IL-8、TNF-α值做Linearity線性趨勢分析顯示其F及P值分別為(129.61，0.00)、(163.01，0.00)和(259.96，0

10、.00)，說明隨著異丙酚劑量的增加，三者的釋放呈遞減趨勢。 2，異丙酚影響LPS刺激THP1細胞作用的蛋白質(zhì)表達譜的變化 (1)三組雙向凝膠電泳圖像清晰，沒有背景條紋的干擾，蛋白質(zhì)斑點分離完全，在相同條件下，反復3次重復的實驗結果圖大致相同，三組圖譜圖象分析后平均檢測到101016個蛋白質(zhì)斑點。選取對照組圖譜作為參考膠，其它兩組膠與參考膠匹配，使各凝膠中的蛋白質(zhì)斑點與參考膠中的對應起來，與參考膠中同一蛋白質(zhì)斑點相匹配的點

11、為同一種蛋白質(zhì)。匹配結果顯示三組膠蛋白質(zhì)斑點匹配百分率約為79.84％。 (2)選擇9個在三組中出現(xiàn)較大變化趨勢的蛋白斑點進行質(zhì)譜鑒定，獲得有效鑒定的四種蛋白質(zhì)分別為Stathmin1、ubiquitin-conjugatingenzymeE2N、ChainA，1113tMutantOfHumanSod1和programmedcelldeath6。經(jīng)查閱文獻，發(fā)現(xiàn)其中Stathmin1與programmedcelldeath6功

12、能上相關，生物信息學分析也提示二者存在間接的相互作用。 結論： 1，LPS可誘導THP1細胞多種細胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α，異丙酚可以劑量依賴的方式抑制IL-6、IL-8和TNF-α的釋放，這可能是其在內(nèi)毒素血癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮保護作用的分子機制之一。 2，建立了重復和穩(wěn)定性較好的單核細胞蛋白質(zhì)的提取方法和2-DE方法，并對通過質(zhì)譜鑒定出的2個差異表達蛋白用western-blot技術

13、進行了更進一步的驗證，與2-DE結果完全一致，從而證明了2-DE結果的可靠性。 3，運用蛋白質(zhì)組學研究獲得有效鑒定的蛋白質(zhì)中有三種蛋白Stathmin1、ubiquitin-conjugatingenzymeE2N、ChainA，1113tMutantOfHumanSod1在LPS刺激THP1細胞后表達上調(diào)，而同時給予異丙酚處理后下調(diào)，另外一種蛋白質(zhì)programmedcelldeath6正好與上述趨勢相反。 說明這四種

14、蛋白質(zhì)在異丙酚抗LPS引起的炎癥反應過程中發(fā)揮重要作用。經(jīng)查閱文獻，發(fā)現(xiàn)Stathmin1與programmedcelldeath6功能上相關，生物信息學分析提示二者存在間接的相互作用。上述結果提示我們這四種蛋白質(zhì)可能在以下方面產(chǎn)生影響。 (1)維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定：在內(nèi)毒素休克過程中，由于呼吸爆發(fā)的產(chǎn)生，大量的氧自由基產(chǎn)生，對組織和細胞產(chǎn)生氧化損傷，因此對抗超氧化的物質(zhì)也增多，如SOD1。為了抵抗氧自由基的損傷作用，SOD1表

15、達增加，以清除過多生成的氧自由基。當給予異丙酚處理后，由于異丙酚能夠抑制細胞中的活性氧產(chǎn)生，于是能夠有效抵抗LPS通過產(chǎn)生氧自由基而引起的細胞損傷作用。當異丙酚的清除氧自由基作用發(fā)揮效力時，活性氧產(chǎn)生不異常增加，不會誘導SOD1表達上調(diào)。LPS刺激THP1細胞后細胞內(nèi)環(huán)境會處于不穩(wěn)定狀態(tài)，ubiquitin-coniugatingenzymeE2N上調(diào)表明由于LPS刺激，細胞對短壽蛋白的降解清除活躍，這樣就可能破壞細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而在

16、LPS刺激同時給予異丙酚處理后，ubiquitin-conjugatingenzymeE2N有恢復趨勢，表明細胞對短壽蛋白的降解清除受到了抑制，因此細胞的內(nèi)環(huán)境趨向于向穩(wěn)定的方向，有助于細胞行使其正常功能。 (2)恢復單核細胞的凋亡障礙：在生長發(fā)育、組織細胞增殖過程中，分化和細胞死亡是處于平衡之中的，并且受到一系列調(diào)控因子的影響。這種平衡的打破通常意味著各種疾病的發(fā)生。LPS刺激單核細胞能夠使細胞stathmin1上調(diào)而使pro

17、grammedcelldeath6下調(diào)，出現(xiàn)凋亡障礙的情況，而這種凋亡障礙是全身炎癥反應綜合征(systemicinflamatoryresponsesyndrome，SIRS)和多器官功能障礙綜合征的重要原因，而異丙酚能夠通過下調(diào)stathminl同時上調(diào)programmedcelldeath6抑制LPS刺激引起的這種凋亡障礙，從而發(fā)揮其抗LPS損傷作用。生物信息學的分析發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)存在間接相互作用也為這一點提供了有力的支持。