機械牽伸對肌腱干細胞中RhoA-ROCK信號分子的影響及其對成骨分化作用的初步觀察.pdf

1、肌腱病是常見的運動損傷性疾病之一,嚴重影響著熱愛運動人群的生活質(zhì)量,特別是運動員的運動生涯。在人的正常生理情況下,運動過程中肌腱的微損傷與肌腱修復(fù)保持著一定的平衡。當(dāng)這種平衡被打破,肌腱微損傷加重,將產(chǎn)生病理變化,最終發(fā)展成為肌腱病。
　　在我們前期的臨床工作中發(fā)現(xiàn),肌腱病患者的肌腱組織中存在著異位骨化,異位骨化是肌腱病的主要病理表現(xiàn)之一,其產(chǎn)生原因可能為肌腱過度使用引起的肌腱微小損傷所致,但肌腱中骨化的組織來源還不是十分清楚。我

2、們課題組進一步研究發(fā)現(xiàn),體外 TSCs在一定的牽伸的條件下,可向成骨方向分化;提示肌腱微損傷與修復(fù)過程中,機械牽伸可能導(dǎo)致TSCs向成骨方向分化,加重肌腱微損傷,致使肌腱自身修復(fù)失敗。因此,TSCs成骨分化控制是肌腱病發(fā)病機制研究的關(guān)鍵科學(xué)問題之一,研究TSCs成骨分化調(diào)控對肌腱微損傷修復(fù)的作用及機制具有重要的科學(xué)意義和臨床價值。
　　在對間充質(zhì)干細胞(MSCs)相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),RhoA是Rho家族的重要一員,具有機械敏感性,機械

3、牽伸可使其激活而發(fā)生生物學(xué)效應(yīng),參與了干細胞成骨過程。ROCK是RhoA家族主要的下游受體,近年研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK信號分子影響干細胞的分化命運。同理推測,在調(diào)控TSCs的成骨分化方面,RhoA/ROCK信號分子可能發(fā)揮了重要作用。機械牽伸是否是通過 RhoA/ROCK信號分子的表達來調(diào)節(jié) TSCs成骨分化,目前還需要進一步探討。
　　基于前人的報道和我們既往的工作基礎(chǔ)上,我們提出以下假說:機械牽伸載荷引起TSCs中 Rho

4、A/ROCK信號分子表達變化,從而促進 TSCs向成骨方向分化,抑制TSCs的RhoA/ROCK信號分子的表達,機械牽伸TSCs后成骨分化減弱。根據(jù)以上假設(shè),我們將課題研究分三部分。
　　1.不同機械牽伸條件對TSCs成骨分化的影響
　　1.1分別從基因表達和蛋白表達兩個方面著手,研究TSCs在不同牽伸條件下,成骨分化指標(biāo)BMP2和Runx2的表達水平及變化趨勢。
　　1.2實驗結(jié)果
　　1.2.1不同牽伸強度對

5、BMP2、Runx2基因表達影響
　　BMP2在牽伸1天時4％、8%牽伸強度下mRNA表達無顯著變化,在牽伸2天和3天時,4%牽伸強度下mRNA表達無顯著變化,8%牽伸強度下BMP2mRNA表達變化上升,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　Runx2在不同時間點(1天、2天、3天),4%和8%牽伸強度下mRNA表達與對照組相比有顯著差異(P<0.05),并且隨牽伸強度的增加而增加。
　　1.2.2不同牽伸強度對BMP

6、2、Runx2蛋白表達影響
　　BMP2在不同時間點4%強度下對照組相比無顯著差異(P>0.05),在牽伸1天、2天時,8%牽伸強度下BMP2表達與對照組相比無顯著提高(P>0.05),牽伸3天時與對照組相比顯著提高。(P<0.05)。
　　Runx2在牽伸1天、2天、3天時,4%強度下與對照組相比無顯著提高(P>0.05);在牽伸1天時,8%牽伸強度下Runx2表達與對照組相比無顯著提高(P>0.05),牽伸2天、3天時與

7、對照組相比顯著提高。(P<0.05)。
　　1.2.3機械牽伸對細胞增殖的影響
　　在不同牽伸時間(1天、2天、3天)的各組中,牽伸應(yīng)變量為4%時,對細胞增殖影響不顯著;牽伸應(yīng)變量為8%時,細胞增殖降低,與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　1.3小結(jié)
　　1.3.1一定的機械牽伸可使TSCs中BMP2和Runx2表達上調(diào)。
　　1.3.2 BMP2和Runx2表達水平隨牽伸強度的增加而增加。<

8、br>　　1.3.3在不同牽伸時間點,4%牽伸強度對TSCs增殖影響不顯著,8%牽伸強度使TSCs增殖降低,4%與8%牽伸強度之間可能為“適度牽伸”與“過度牽伸”的臨界點。
　　2.不同機械牽伸條件對TSCs中RhoA/ROCK信號分子表達的影響
　　2.1分別從基因表達和蛋白表達兩個方面著手,研究 TSCs在不同牽伸條件下, RhoA、ROCK分子的表達水平及變化趨勢。
　　2.2實驗結(jié)果
　　2.2.1機械牽

9、伸對TSCs中RhoA、ROCK基因表達水平的影響
　　在不同牽伸時間(1天、2天、3天)的各組中,RhoA、ROCK基因表達均隨牽伸強度的增加呈遞增趨勢;具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　2.2.2機械牽伸對TSCs中RhoA、ROCK蛋白表達的影響
　　在牽伸1天后,不同應(yīng)變量下RhoA、ROCK蛋白表達水平變化不顯著(P>0.05),牽伸2天、3天后,4%、8%牽伸應(yīng)變量與對照組相比,RhoA、ROCK蛋白表

10、達呈遞增趨勢(P<0.05)。
　　2.3小結(jié)
　　2.3.1機械牽伸可使TSCs中RhoA和ROCK信號分子表達上調(diào)。
　　2.3.2 RhoA和ROCK表達水平隨牽伸強度增加而上升。
　　3.抑制RhoA/ROCK信號分子對牽伸誘導(dǎo)的TSCs成骨分化的影響。
　　3.1在牽伸條件下,從基因表達方面,研究RhoA、ROCK分子對TSCs成骨分化指標(biāo)Runx2表達的影響。
　　3.1.1實驗條件及分組

11、
　　牽伸應(yīng)變量為8%;牽伸頻率為1Hz;牽伸時間為4h/d,牽伸3d;實驗分組:TSCs不牽伸;TSCs+牽伸;TSCs+C3毒素+牽伸;TSCs+Y27632+牽伸
　　3.1.2收集細胞進行Real-time PCR檢測。
　　3.2實驗結(jié)果
　　3.2.1 TSCs在8%牽伸強度,4h/d,連續(xù)牽伸3天條件下成骨分化相關(guān)因子Runx2基因表達增加。
　　3.2.2加入RhoA抑制劑C3毒素的TSCs

12、在上述條件牽伸后Runx2基因表達較沒有添加C3毒素組下調(diào)。
　　3.2.3加入ROCK抑制劑Y27632的TSCs在上述條件牽伸后Runx2基因表達較沒有添加Y27632毒素組下調(diào)。
　　3.3小結(jié)
　　3.3.1 C3毒素抑制RhoA后,可使機械牽伸誘導(dǎo)的TSCs成骨分化相關(guān)因子表達水平下降。
　　3.3.2 Y27632抑制ROCK后,可使機械牽伸誘導(dǎo)的TSCs成骨分化相關(guān)因子表達水平下降。
　　3.