富血小板血漿誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞增殖分化對肌腱微損傷修復(fù)的作用.pdf

1、肌腱病(tendinopathy)是骨科學(xué)、運(yùn)動醫(yī)學(xué)和職業(yè)病醫(yī)學(xué)的常見病之一。統(tǒng)計表明，每年至少有3000萬的肌腱病病例。大量研究表明：過度牽伸載荷導(dǎo)致肌腱的微損傷及不成熟的修復(fù)是其發(fā)生的直接原因，但確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。臨床上對肌腱病的治療主要包括物理治療、修復(fù)與重建。修復(fù)手術(shù)包括：局部病灶清除等；重建手術(shù)主要針對肌腱病修復(fù)失敗；目前重建手段有：自體肌腱移植、同種異體肌腱移植，組織工程肌腱移植等。面臨的共同問題是：缺乏具有強(qiáng)烈修復(fù)能

2、力的細(xì)胞、缺乏促進(jìn)肌腱修復(fù)的微環(huán)境。
　　 近年來，隨著細(xì)胞治療及干細(xì)胞治療研究的發(fā)展，人們開始使用細(xì)胞療法和干細(xì)胞療法來促進(jìn)肌腱的恢復(fù)。常用的細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、脂肪干細(xì)胞(ADSCs)等等。2007年，Bi et al.發(fā)現(xiàn)肌腱里含有新的類型細(xì)胞-肌腱干/祖細(xì)胞(Tendon stem/progenitor cells，TSCs)。是肌腱細(xì)胞的前體細(xì)胞，這些細(xì)胞具有干細(xì)

3、胞的普遍特征；TSCs在生理狀態(tài)下可分化、增殖成肌腱細(xì)胞；TSCs在病理狀態(tài)下可分化為成骨、成脂、成軟骨細(xì)胞及成肌腱細(xì)胞；TSCs對肌腱損傷修復(fù)及保持肌腱微環(huán)境起著關(guān)鍵性的作用；TSCs的發(fā)現(xiàn)勢必為運(yùn)用干細(xì)胞治療的方法治療肌腱病提供可能。
　　 肌腱是連接肌肉和骨骼的纖維結(jié)締組織，經(jīng)常要承受很強(qiáng)的機(jī)械壓力，從而傳遞肌肉產(chǎn)生的張力維持關(guān)節(jié)的活動和穩(wěn)定。在受力的過程中，肌腱會改變新陳代謝，并適時改變其結(jié)構(gòu)及力學(xué)特性。因此，深入理解新

4、分離的TSCs對機(jī)械壓力的響應(yīng)，將對我們了解肌腱在受力環(huán)境下生理學(xué)的變化非常必要。富血小板血漿(platelet-richplasma，PRP)含有大量的生長因子，如PDGF、EGF、TGF-β1、IGF等，這些因子對肌腱的修復(fù)及保持肌腱微環(huán)境具有很大的促進(jìn)作用。有文獻(xiàn)報道，PRP的激活態(tài)(PRCR)能促進(jìn)TSCs的增殖及膠原蛋白的產(chǎn)量。在體內(nèi)，PRCR促進(jìn)了肌腱細(xì)胞的增殖及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，而這些是肌腱的主要組成部分。然而，T

5、SCs在受力過后，PRCR對TSCs分化的作用并未見報道。本研究將詳細(xì)研究PRP對受力后的TSCs的影響，以進(jìn)一步確定PRP對肌腱修復(fù)的作用及其機(jī)制。
　　 目的：
　　 1、通過分離、鑒定大鼠肌腱干細(xì)胞(TSCs)，發(fā)現(xiàn)其具有干細(xì)胞的普遍特性，包括克隆、增殖、多向分化潛能；
　　 2、明確機(jī)械牽拉對TSCs增殖及分化的影響；
　　 3、探查富血小板血漿對TSCs增殖及分化的影響；
　　 4、分析

6、富血小板血漿復(fù)合TSCs對肌腱急性損傷的作用；
　　 5、通過富血小板血漿復(fù)合TSCs為肌腱病修復(fù)提供新的手段。
　　 方法：
　　 1.大鼠肌腱干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定：8周齡SD大鼠取后肢的跟腱，分離、培養(yǎng)具有多向分化潛能的肌腱干細(xì)胞。研究其克隆形成能力及不同代數(shù)的形態(tài)學(xué)變化。采用流式細(xì)胞術(shù)測定干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志，利用免疫熒光檢測肌腱相關(guān)蛋白及軟骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，并研究其向成骨、成脂及成軟骨細(xì)胞方向分化的能力

7、。
　　 2.機(jī)械載荷對TSCs增殖及分化的影響：我們首先研制出一套TSCs循環(huán)牽伸載荷系統(tǒng)，建立體外肌腱干細(xì)胞過度牽拉模型并予以測試。使用這套體外裝置，我們系統(tǒng)的研究了不同強(qiáng)度的機(jī)械牽拉對TSCs形態(tài)學(xué)、增殖、周期及凋亡的影響，并通過檢測成骨、成脂、成軟骨標(biāo)志基因的表達(dá)來分析TSCs分化的改變。
　　 3.富血小板血漿對TSCs增殖及分化的影響：研究TSCs在受力過后，PRP對TSCs增殖、分化及相關(guān)基因表達(dá)的影響。應(yīng)

8、用Western blot檢測肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)，并通過流式細(xì)胞術(shù)確定各組陽性細(xì)胞所占的比例。應(yīng)用ELISA檢測TGF-β1與VEGF的表達(dá)。
　　 4.富血小板血漿復(fù)合肌腱干細(xì)胞治療急性肌腱損傷：48只經(jīng)肉毒桿菌毒素處理的大鼠作為unloaded組，另外48只作為loaded組。隨機(jī)將大鼠分為4組：A組-PBS處理，B組-PRP處理，C組-TSCs處理，D組-PRP+TSCs處理。移植后3天及14天，取

9、跟腱組織進(jìn)行組織學(xué)、免疫組化及基因表達(dá)檢測。
　　 5.富血小板血漿復(fù)合肌腱干細(xì)胞治療慢性肌腱損傷：26只大鼠通過度運(yùn)動建立慢性肌腱病模型。其中24只大鼠被隨機(jī)分為4組，并做相應(yīng)的注射處理：對照、PRP、TSCs、PRP+TSCs。剩下的兩只通過注射綠色熒光蛋白標(biāo)記的TSCs做體內(nèi)細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)。4周及8周后，取材并分析肌腱組織的病理組織學(xué)及基因表達(dá)情況，以評價肌腱組織的修復(fù)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功的分

10、離出大鼠肌腱干細(xì)胞TSCs。TSCs具有克隆形成能力及很高的增殖能力。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，TSCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志CD44及CD90，CD34及CD31表達(dá)均為陰性。免疫熒光結(jié)果表明，P3代TSCs表達(dá)α-SMA、tenascin C、aggrecan及ColⅠ呈陽性，而ColⅡ表達(dá)陰性。TSCs具有向成骨、成脂、成軟骨細(xì)胞分化的能力。
　　 2.TSCs在受力條件下，細(xì)胞沿微槽貼壁生長良好，細(xì)胞明顯拉長：細(xì)胞增殖能力增加，并隨著受

11、力強(qiáng)度的增加而大幅增加；4%機(jī)械拉伸有利于TSCs向肌腱細(xì)胞方向分化。而加載8%機(jī)械拉伸后對TSCs向多個方向的分化均有利。
　　 3.富血小板血漿明顯促進(jìn)了TSCs增殖，并促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF-β1的表達(dá)。同時，成骨及成脂標(biāo)志基因明顯降低，表明TSCs受力過后，PRP促進(jìn)了其向肌腱細(xì)胞方向分化，并抑制向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化，從而降低了脂肪小滴累積、粘液性的變性及組織的鈣化。
　　 4.在受力條件下，T

12、SCs復(fù)合PRP處理對急性肌腱損傷愈合具有協(xié)同促進(jìn)作用。受力促進(jìn)了TSCs的增殖及分化成肌腱細(xì)胞，改善了肌腱的修復(fù)效果，Ⅰ、Ⅲ型膠原及Smad8的表達(dá)量增加。
　　 5.TSCs復(fù)合PRP改善了慢性肌腱損傷肌腱的結(jié)構(gòu)，膠原含量增加。8周后注射的TSCs仍然存活，并可實(shí)現(xiàn)追蹤。免疫組化結(jié)果顯示，PRP復(fù)合TSCs移植增加了損傷肌腱處Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)，而Rundx2、PPARγ、SOX9的表達(dá)受到抑制。
　　 結(jié)論：

13、>　　 1.TSCs的成功分離和鑒定有助于我們更清晰的了解其在肌腱生理、康復(fù)及發(fā)病過程中的作用，從而為運(yùn)用干細(xì)胞治療的方法治療肌腱病提供可能。
　　 2.適度的壓力可能會促進(jìn)TSCs自我更新或向肌腱細(xì)胞分化，而高強(qiáng)度的壓力是有害的，因?yàn)樗T導(dǎo)TSCs向非肌腱細(xì)胞分化，如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞，或三者的混合體，在體內(nèi)表現(xiàn)為脂肪積累、類粘蛋白形成或組織鈣化等肌腱病癥狀。
　　 3.富血小板血漿通過誘導(dǎo)TSCs向肌腱細(xì)