富血小板血漿(PRP)對肌腱干細胞生物學影響的研究.pdf

1、肌腱病(Tendinopathy)的發(fā)病率極高，是骨科、運動醫(yī)學、康復醫(yī)學、職業(yè)病防治和老年醫(yī)學的常見疾病。肌腱病嚴重影響人們的工作與生活，特別影響運動員競技水平的發(fā)揮，常迫使優(yōu)秀運動員提早退役。肌腱病的主要臨床表現(xiàn)為肌腱或肌腱-骨胳連接處的疼痛、壓痛甚至斷裂、關節(jié)活動度受限。肌腱腱病最常見的發(fā)病部位依次為髕腱、跟腱、岡上肌腱肩袖、指深屈肌腱及肱骨外上髁伸肌總腱止點。足底筋膜炎、跟腱炎、髕腱炎、網(wǎng)球肘、高爾夫肘、岡上肌腱炎都是肌腱病。雖

2、然肌腱病如此常見，其發(fā)病機制仍不清楚，常認為與肌腱韌帶的急慢性損傷有關。
　　 新近發(fā)現(xiàn)的肌腱干/祖細胞(Tendon stem/progenitor cells，TSPCs)，也稱為肌腱干細胞(tendon stem cells，TSCs)或肌腱源性干細胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)，經(jīng)傳代培養(yǎng)后可直接成為腱細胞，具有成體干細胞的自我復制和誘導成脂、成軟骨、成骨分化的潛能，是腱細胞的前體細

3、胞。研究表明，TSCs參與肌腱的急慢性損傷修復，是肌腱急慢性損傷修復過程中的關鍵效用細胞。不同劑量的反復循環(huán)機械應力刺激可影響肌腱干細胞力學生物學行為，進一步導致肌腱內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和肌腱病的發(fā)生。應用體外循環(huán)機械牽伸系統(tǒng)模擬細胞在體反復機械應力狀態(tài)，證明4％的機械拉伸能增加TSCs增殖、促進TSCs成為腱細胞，然而8％的機械拉伸可誘導TSCs分化為脂肪、軟骨和骨細胞?？梢?，小的機械拉伸（有序和適度的體育鍛煉）可促進TSCs增殖并成為腱細胞

4、，有利于肌腱的強壯及肌腱的健康;而持續(xù)較大的機械負荷（如過度勞損）是有害的，它促使肌腱干細胞分化為非腱細胞，導致脂肪堆積、黏液形成和肌腱鈣化，表現(xiàn)為肌腱病的典型病理變化?？梢姡琓SCs可能是探索肌腱病的突破口。
　　 因為對肌腱病還沒有本質(zhì)認識，臨床治療還往往是經(jīng)驗性的。治療方法包括:局部制動休息、減負訓練、按摩冷療、離心型運動、口服非甾體類抗炎藥物、局部注射富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)、細胞

5、療法、體外沖擊波術、嚴重時可給予糖皮質(zhì)激素等治療。對于保守治療無效、臨床癥狀持續(xù)較重者，可給予外科手術治療。在這些治療方法中，PRP局部注射具有自體來源、制作簡單、可制作成凝膠狀、臨床使用安全、方便、經(jīng)濟等優(yōu)點，倍受醫(yī)生和患者的歡迎。因此，臨床應用PRP局部注射治療“肌腱病”值得我們關注。
　　 PRP是全血經(jīng)過梯度離心分離獲得的、含有超過基線水平的濃縮血小板血漿。一般而言，血小板含量至少要達到正常血的3-5倍才能稱之為PRP。

6、當PRP被激活后，其血小板釋放出大量的生長因子，包括血小板衍生生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)，纖維生長因子(FGF)，內(nèi)皮細胞生長因子(EGF)，血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子(PDEGF)，胰島素樣生長因子(IGF)等。這些生長因子對細胞的增殖和分化有著重要的作用，能夠刺激損傷組織血管神經(jīng)化、為細胞修復或再生損傷組織提供血供和營養(yǎng)。
　　 體外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PRP能促進TSCs增

7、殖和成腱細胞形成，動物實驗研究也已證實這一結(jié)果，一些臨床試驗也已經(jīng)驗證PRP能夠促進肌腱和韌帶急慢性損傷的愈合和有效治療肌腱病。然而，PRP局部注射治療肌腱和韌帶的急慢性損傷和肌腱病并不總是令人滿意，有一些臨床試驗卻發(fā)現(xiàn)PRP對肌腱和韌帶急慢性損傷的修復和肌腱病的治療無益。因此，應用PRP治療肌腱病仍需進一步基礎與臨床研究。
　　 我們知道，臨床應用的PRP是個體化準備的，沒有明確的定義。因而，每一個人的PRP都可能不一樣，并且

8、在某些情況下，有些病人不能成功獲得PRP。仔細分析PRP的制備過程及其組成成份，我們發(fā)現(xiàn)只有兩類（共有4種）不同的PRP在臨床使用;其中一類含白細胞(L-PRP和L-PRF)，另一類不含白細胞(P-PRP、P-PRF)。有研究發(fā)現(xiàn)應用富含白細胞的PRP有較乏白細胞的PRP更為嚴重的急性炎癥反應。因為TSCs是肌腱急慢性損傷修復的關鍵效用細胞，我們假設L-PRP不利于肌腱和韌帶的愈合是因為L-PRP會抑制TSCs的正?；钚?。
　　

9、 本課題為證實上述假設共分為3章，即肌腱干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定;P-PRP和L-PRP的制備和鑒定;P-PRP和L-PRP對TSCs增殖、分化和細胞力學的影響。研究目的是為臨床合理應用PRP局部注射治療肌腱病提供理論依據(jù)。
　　 第一章兔肌腱干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:分離和鑒定兔肌腱干細胞(TSCs)并評估其干細胞特性為下一步實驗做準備。研究內(nèi)容包括:(1)TSCs的分離及培養(yǎng);(2)TSCs的克隆形成能力

10、及增殖能力檢測;(3)TSCs的流式細胞儀及免疫熒光鑒定;(4)TSCs的成脂、成軟骨、成骨分化能力測定。
　　 方法:從新西蘭大白兔中獲取TSCs已經(jīng)匹茲堡大學實驗動物應用學會批準(IACUC批準號:1105545A)。選用3月齡健康雄性新西蘭大白兔。兔處死后從后肢的跟腱取細胞并進行TSCs培養(yǎng)，觀察克隆形成、進行干細胞鑒定和到P3后行成脂、成軟骨、成骨誘導。
　　 結(jié)果:體外培養(yǎng)7天后，肌腱來源細胞(Tendon-d

11、erived cells，TDCs)已經(jīng)形成克隆。流式細胞術對細胞表面抗原標志進行了分析，結(jié)果顯示TDCs表面抗原干細胞標志CD90、CD44均呈強陽性。免疫熒光的方法對干細胞特征性標志物(NS，Nanog， Oct-4，SSEA4)進行了檢測，染色細胞經(jīng)免疫熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示80％的TDCs細胞均表達陽性。成脂誘導分化后，細胞增殖緩慢，細胞中出現(xiàn)脂滴，并逐漸增大、融合，油紅-O染色可見細胞內(nèi)大小不等的紅色脂滴。成軟骨誘導分化4周

12、，固定細胞，經(jīng)番紅-O染色，細胞微團被染為紅色。成骨誘導分化4周后，TDCs細胞呈層疊樣生長，局部出現(xiàn)鈣鹽沉積，形成礦化結(jié)節(jié)，鈣鹽沉積處Alizarin red S染色成紅色。
　　 小結(jié):本研究獲取的TDCs是肌腱干細胞(TSCs)，具有克隆形成能力及快速增殖能力，細胞表面抗原CD90、CD44表達呈陽性，而CD34表達呈陰性，干細胞特異性標志物NS、Nanog、SSEA4和OCT-4表達陽性，在成骨、成脂和成軟骨誘導條件下，

13、可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等，具有多向分化潛能，可用于下一步研究。
　　 第二章 P-PRP和L-PRP的制備及P-PRP及L-PRP對TSCs的影響
　　 為了明確是否是PRP中的白細胞影響了PRP的療效，本研究將分別制備P-PRP和L-PRP及研究P-PRP與L-PRP對TSCs的作用，以進一步確定L-PRP對肌腱韌帶修復的不利影響，明確P-PRP對肌腱韌帶修復的積極作用。
　　 方法:選用3月齡

14、、體重2.5kg的健康雄性新西蘭大白兔8只(匹茲堡大學實驗動物中心提供，IACUC Protocol number:1105545A)，乙醚麻醉后，在嚴格無菌條件下，用預先含有3.8％ACD抗凝劑(sodium citrate)溶液的注射器從心臟采集新鮮抗凝血并置于冰水混合物中。小心緩慢地將6mL的新鮮血注入盛有6mL Polymorphprep(Accurate Chemical&Scientific Crop NY)的試管中，置4℃

15、離心機中予以400g/m離心30分鐘后手工分離出P-PRP和L-PRP，應用自動細胞計數(shù)儀(Nexcelom Bioscience LLC，Lawrence，Massachusetts)對P-PRP和L-PRP所含的白細胞進行計數(shù)。P-PRP和L-PRP均用22mM CaCL2進行激活并存于4℃冰箱中備下一步實驗用。將準備好P-PRP和L-PRP培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中除含或未含P-PRP或L-PRP外，其他成分一樣（20％胎牛血清

16、、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、低糖DMEM），分析各培養(yǎng)基中的細胞因子;將兔來源的TSCs接種在含P-PRP、L-PRP(0％，2％，5％，10％)培養(yǎng)基或普通培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中(10000個細胞/孔)并在37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng);培養(yǎng)至1、2、4天觀察細胞形態(tài)，至第4天用自動細胞計數(shù)儀(Nexcelom Bioscience LLC，Lawrence，Massachusetts)行細胞計數(shù)并計算PDT，流式細胞

17、儀檢測其干細胞特征性細胞表面標志物;觀察P-PRP組、L-PRP組和對照組TSCs經(jīng)成脂、成軟骨和成骨誘導28天后其多分化潛能;qRT-PCR分析P-PRP和L-PRP對TSCs基因表達的影響，PRP與白細胞對TSCs的相互影響;CTFM測定P-PRP和L-PRP對TSCs細胞力學的影響。
　　 結(jié)果:加入離心液一次梯度離心可制備高濃度的PRP。PRP中的血小板量為1.44×108±0.84×108/mL(P＜0.05)，與全血

18、比較，其血小板濃縮率為3.25±0.73。P-PRP中的白細胞數(shù)為0.6625×105±0.36×105/mL，L-PRP中的白細胞數(shù)為3.2775×105±1.22×105/mL(P=0.019)(mean±SD，n=8)。所有培養(yǎng)基(P-PRP培養(yǎng)基、L-PRP培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基)均在配制好后即用ELISA法測定其生長因子(PDGF, EGF, TGF-β1，VEGF)的濃度。P-PRP培養(yǎng)基有較L-PRP培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基更高濃度

19、的生長因子，特別是EGF和TGF-β1。L-PRP培養(yǎng)基中VEGF濃度較普通培養(yǎng)基還低，說明白細胞可能抑制PRP釋放生長因子(P-PRP與L-PRP培養(yǎng)基比較，P＜0.05，n=3); L-PRP培養(yǎng)基組不貼壁細胞增加;其干細胞特征性細胞表面標志物CD44和CD90發(fā)生變化，經(jīng)P-PRP處理，CD44和CD90都表達增加，經(jīng)L-PRP處理則相反(P-PRP與L-PRP組比較，P＜0.05，n=3); PDT與PRP白細胞的濃度有關，當增

20、加P-PRP的濃度或降低L-PRP濃度時，PDT縮短（組內(nèi)和組間比較，P＜0.05，n=3）;培養(yǎng)4天、14天后，L-PRP的濃度越高，Nanog、Oct4基因表達越下調(diào)(L-PRP組內(nèi)和L-PRP組與P-PRP組比較，P＜0.05，n=3);經(jīng)28天的成脂、成軟骨和成骨誘導后，P-PRP培養(yǎng)基組、L-PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組的TSCs均被成功誘導。然而，L-PRP培養(yǎng)基組陽性細胞染色數(shù)明顯較P-PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組。與P-

21、PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組比較，L-PRP培養(yǎng)基組成脂、成軟骨和成骨分化明顯增加（組內(nèi)比較，P＜0.05，n=3）;各基因與P-PRP和L-PRP的濃度密切相關。L-PRP的存在，PPARγ、SOX-9、Runx-2、mPGEs基因表達就明顯上調(diào)。(L-PRP組內(nèi)和L-PRP組與P-PRP組比較，P＜0.05，n=3); L-PRP培養(yǎng)基組的最大細胞收縮力明顯小于P-PRP培養(yǎng)基組和普通培養(yǎng)基組，組間比較有顯著性差異(P=0.006、

22、0.002，n=5)，但P-PRP培養(yǎng)基組與普通培養(yǎng)基比較則未見顯著性差異(P=0.609、0.002，n=5); WBC組的COX-1和COX-2基因明顯上調(diào)，但WBCs的這種作用可以明顯被PRP抵消;PRP組Ⅰ型膠原基因(Col-I)表達上調(diào)，但這種作用可以明顯被WBC處理抑制;WBC組還明顯有MMP-13基因表達的增加，這種表達增加可以被PRP抵消。
　　 小結(jié):本研究中通過加入離心液一次梯度離心分離制備出P-PRP和L-

23、PRP，其所含的白細胞有顯著的差異。與P-PRP和空白對照比較，L-PRP會抑制TSCs的增生、加速TSCs的分化、并使TSCs脆性增加;經(jīng)WBCs處理后，TSCs的炎癥反應介質(zhì)基因COX-1和COX-2表達增加，細胞分解代謝的基因Ⅰ型膠原表達減少但MMP-13表達增加。這些發(fā)現(xiàn)支持臨床所見的肌腱病發(fā)病機制，因而，我們可以合理地推斷P-PRP可以促進肌腱韌帶的愈合而L-PRP可能抑制肌腱韌帶的愈合。因此，我們應該用P-PRP而不是含有白

24、細胞的L-PRP治療肌腱病。
　　 第三章 P-PRP膠-TSCs復合物的構建及TSCs的體內(nèi)、外示蹤
　　 將P-PRP膠作為載體負載TSCs構建成P-PRP膠-TSCs復合物并植入目標部位，并監(jiān)測TSCs植入體內(nèi)后其生物學活性。
　　 方法:應用SPIO標記TSCs、分析SPIO對TSCs生物學功能的影響;構建P-PRP膠-TSCs復合物;體外MRI觀察經(jīng)SPIO標記的TSCs在P-PRP膠內(nèi)的分布情況;建立

25、兔髕韌帶窗式缺損模型，用P-PRP膠-TSCs復合物進行修復，MRI連續(xù)檢測追蹤經(jīng)SPIO標記的TSCs并檢驗P-PRP膠作為載體的可行性;免疫熒光檢測評價P-PRP膠-TSCs植入體內(nèi)3周后其TSCs的Ⅰ型膠原合成能力，以觀察TSCs植入體內(nèi)3周后的生物學性能;明確P-PRP膠作為TSCs載體用于治療急慢性肌腱損傷和肌腱病的可行性。
　　 結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)TSCs經(jīng)胞吞作用攝入SPIO，可見SPIO在細胞漿內(nèi)并圍繞在細胞核周圍。

26、細胞標記率約98％。經(jīng)SPIO標記的TSCs細胞形態(tài)未見明顯改變;細胞增殖也未見明顯改變，表現(xiàn)為PDT與未標記TSCs比較無顯著性統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，說明SPIO標記不會影響細胞的增殖功能;分別于標記后2、4、7天檢測細胞的活力，發(fā)現(xiàn)其活力都在90％左右，與未標記細胞比較也無明顯差異，說明SPIO標記不會明顯干擾TSCs的細胞活力(P＞0.05);經(jīng)免疫組織化學方法證實SPIO標記組TSCs和未標記組nucleostemin和N

27、anog表達率都為約90％，沒有明顯差別(P＞0.05);經(jīng)qRT-PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)標記TSCs和未標記TSCs相比，在標記后4、7、14天，其Oct-4和Nanog基因表達都沒有明顯差別(P＞0.05);經(jīng)21天的成脂、成軟骨和成骨分化，兩組未見明確差異;其PPAR、Sox9和Runx2基因表達也無明顯差異(P＞0.05)。體外P-PRP膠-TSCs復合物經(jīng)3T MR掃描發(fā)現(xiàn)經(jīng)SPIO標記的TSCs其MRI信號與標記細胞數(shù)呈線性改

28、變，說明TSCs可均勻分散在P-PRP膠中;體內(nèi)P-PRP膠-TSCs復合物經(jīng)3T MR掃描發(fā)現(xiàn)經(jīng)SPIO標記的TSCs連續(xù)3周其MRI信號沒有明顯變化。術后3周局部表現(xiàn)為肌腱缺損已有組織填充，經(jīng)普魯氏蘭染色證實MRI顯影的細胞就是經(jīng)SPIO標記的TSCs，說明TSCs能持續(xù)停留在目標部位至少3周。從組織修復的角度考慮，3周的時間足于完成急性炎癥期，目的細胞能停留在目標部位3周以上就可能發(fā)揮其生理功能，達到治療目的。再次，經(jīng)免疫組織化學

29、染色證實P-PRP膠負載的TSCs在體內(nèi)3周后出現(xiàn)明顯的Ⅰ型膠原的表達，說明TSCs已經(jīng)發(fā)揮生理作用?？梢奝-PRP膠可以作為TSCs細胞治療或組織工程的載體。
　　 小結(jié):用SPIO標記TSCs不會明顯干攏其干性、負載TSCs的P-PRP膠修復兔髕韌帶窗式缺損術后2周和3周連續(xù)經(jīng)MRI觀察均未見明顯影像學改變、經(jīng)普魯氏蘭染色證實MRI顯影的細胞就是SPIO標記的TSCs，說明存在于P-PRP膠內(nèi)作為目的細胞的TSCs可以穩(wěn)定維

30、持在目標部位，且TSCs植入體內(nèi)3周后能合成Ⅰ型膠原，說明TSCs可用SPIO進行標記、P-PRP膠可作為TSCs的良好載體。
　　 結(jié)論:本研究成功地從兔跟腱分離培養(yǎng)出TDCs。這些細胞有克隆形成能力、快速增殖能力和多向分化潛能，經(jīng)流式細胞儀證實干細胞表面特征性標志物陽性，經(jīng)免疫熒光染色證實干細胞特征標志物染色陽性，從而確定為肌腱干細胞;經(jīng)一次離心可簡便制備出較高濃度的PRP并成功分離出P-PRP和L-PRP;發(fā)現(xiàn)L-PRP，