微流控芯片和氧化石墨烯在乙型肝炎檢測與預(yù)防中的應(yīng)用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)的感染不僅可引起急、慢性病毒性肝炎(Acute and chronic hepatitis)，而且還與肝硬化(Liver cirrhosis，LC)和原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，目前我國HBV感染者約有9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬人。乙型肝炎病毒可分為A到J共10個基

2、因型，我國以B、C基因型占優(yōu)勢?；蛐筒町惒粌H影響e抗原的血清學(xué)轉(zhuǎn)換、前C區(qū)啟動子和前C區(qū)的突變位點、疾病的發(fā)展進程，還與抗病毒療效有關(guān)?；蚍中驮\斷有助于臨床醫(yī)生針對患者制定個體化的治療方案。
　　為了克服目前HBV基因分型法存在的檢測時間長、靈敏度低、特異性差等缺點，我們將微流控芯片、巨磁阻傳感器、磁性納米團簇、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop mediatedisothermal amplification，LAMP)以及線性探針雜

3、交技術(shù)相結(jié)合，建立了一種快速區(qū)分中國HBV優(yōu)勢基因型B和C的微流控芯片檢測方法，它集樣品混合、核酸擴增和信號采集等多功能于一體，具有檢測時間短、靈敏度高、特異性以及抗干擾能力強等優(yōu)點。
　　本論文首先建立了一種集成巨磁阻傳感器、微流控芯片、磁性納米團簇、PCR擴增和核酸雜交于一體的乙型肝炎病毒基因分型檢測方法。172 nm左右的磁性納米團簇表面修飾有鏈霉親和素，可與“PCR產(chǎn)物——核酸探針”雜交復(fù)合物末端的生物素發(fā)生特異性結(jié)合，G

4、MR傳感器可對停留其表面的磁性納米團簇進行檢測，檢測靈敏度初步達到200 IU·mL-1(103 copies·mL-1)。隨后，又對該檢測方法進行了優(yōu)化升級:我們將環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)集成在微流控芯片中，進行核酸樣品的高效擴增。同時，GMR傳感器不再集成在微流控芯片中，而是作為獨立檢測器以供重復(fù)使用。最終可在一小時內(nèi)實現(xiàn)最低10 copies·mL-1 HBV DNA的基因分型檢測。此后，為了在微流控芯片上實現(xiàn)核酸擴增前核酸樣本與反應(yīng)試

5、劑的快速高效混合，我們基于仿生學(xué)的原理，設(shè)計了一種由高深寬比的直通道單元與高寬深比的圓形室單元重復(fù)交替相連而成的微混合器。
　　此外，為了評估氧化石墨烯作為HBV疫苗免疫佐劑的可能性，我們通過體外細(xì)胞實驗分別研究了氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）和經(jīng)過PVP修飾的氧化石墨烯(PVP-GO)對樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等主要免疫細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，氧化石墨烯經(jīng)PVP修飾后，其免疫學(xué)毒性明顯降低，并具有一定的免