ZAG對LPS誘導的HepG2細胞的NF-κB炎癥信號通路的影響及機制.pdf

1、第一部分人鋅alpha-2糖蛋白真核載體的建立及ZAG對LPS誘導HepG2細胞的TNF-α的影響
　　目的：
　　構建重組人鋅 alpha-2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein，ZAG)真核表達載體，并瞬時轉染至HepG2細胞，探討ZAG對LPS誘導的HepG2細胞中的炎癥細胞因子TNF-α的影響。
　　方法：
　　1、提取HepG2細胞總RNA，RT-PCR法擴增hZAG全基因表達序列，雙酶切法

2、將擴增后的hZAG全基因表達序列插入表達質粒pIRES2-ZsGreen1中構建pIRES2-ZsGreen1(-)-hZAG真核表達質粒，經(jīng)PCR擴增方法和核苷酸測序驗證后通過脂質體轉染 pIRES2-ZsGreen1-hZAG序列瞬時轉染至HepG2細胞中，使用熒光倒置顯微鏡觀察瞬時表達及轉染效率，提取總RNA，RT-PCR檢測hZAG表達情況。
　　2、體外培養(yǎng)HepG2細胞，通過脂質體瞬時轉染pIRES2-ZsGreen1

3、-hZAG后，用脂多糖LPS（1μg/mL）分別干預0h，2h，4h，8h，12h，24h。提取總RNA，采用熒光定量PCR技術檢測脂肪細胞因子ZAG和炎癥因子TNF-α的mRNA的表達。
　　結果：
　　成功克隆人ZAG cDNA全序列，在限制性核酸內切酶SacII和XhoI的作用下，與pIRES2-ZsGreen1空白載體片段連接，構建成pIRES2-ZsGreen1(-)-hZAG表達質粒，并由核苷酸序列測定證實。pI

4、RES2-ZsGreen1(-)-hZAG成功瞬時轉染至HepG2細胞，在轉染的HepG2細胞中 ZAG基因表達明顯上調。選用LPS誘導 HepG2細胞發(fā)生炎癥反應，TNF-α的表達在2h明顯增高，過表達ZAG組TNF-α在2h表達較對照組降低，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1、成功構建hZAG真核表達載體，建立過表達ZAG的HepG2細胞系。
　　2、ZAG過表達可以降低LPS誘導的HepG2細胞中炎癥因子T

5、NF-α的表達。
　　第二部分鋅 alpha-2糖蛋白抑制LPS誘導的HepG2細胞NF-κB炎癥信號通路的研究
　　目的：
　　探討鋅α2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein，ZAG)對LPS誘導的HepG2細胞NF-κB炎癥信號通路的影響。
　　方法：
　　培養(yǎng)HepG2細胞，通過脂質體瞬時轉染pIRES2-ZsGreen1-hZAG后，并分別用LPS聯(lián)合NF-κB抑制劑BAY11-7082

6、干預，應用Western blot檢測核轉錄因子激酶IKKβ、核轉錄因子P65、核轉錄因子P50的表達。應用免疫熒光方法觀察在LPS干預下的磷酸化P65核移位情況。
　　結果：
　　1、Western blot法顯示在無藥物干預的情況下，ZAG組中NF-κB相關因子表達無明顯差異；在LPS干預下誘導炎癥反應后，ZAG組中IKKβ、p65、p50的表達較對照組及空白質粒組具有明顯差異；在 NF-κB抑制劑BAY11-7082和

7、LPS的聯(lián)合作用下，ZAG能增強BAY11-7082的抑制作用，降低IKKβ、p65、p50的蛋白表達。
　　2、采用細胞免疫熒光技術證實在未轉染組中，LPS刺激后磷酸化 P65具有明顯核移位的趨勢；在 ZAG組的細胞中,磷酸化 p65的核移位被抑制，在NF-κB抑制劑BAY11-7082和LPS的聯(lián)合作用下，ZAG能增強BAY11-7082的抑制作用，抑制磷酸化P65的核移位。
　　結論：
　　ZAG能夠抑制由LPS