鹽酸川芎嗪通過(guò)mTOR信號(hào)通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖.pdf

1、前列腺癌是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在腫瘤中死亡率居于第六位，全世界每年大約有903，500個(gè)新增病例，其中258，400人死亡。近年來(lái)，隨著診斷技術(shù)的提高，篩選程序的有效開(kāi)展，在包括中國(guó)等亞歐國(guó)家中，前列腺癌發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)?？剐奂に丿煼ㄔ谥委煶跗诖_實(shí)起到了一定的效果，但隨著治療的進(jìn)行，患者在幾年內(nèi)不可避免地對(duì)激素治療發(fā)生抵抗，即去勢(shì)抵抗性前列腺癌。對(duì)于這種對(duì)內(nèi)分泌治療不敏感的激素非依賴性前列腺癌，始終沒(méi)有較理想的治療方法，已日益成

2、為臨床亟待解決的難題。
　　PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是前列腺癌的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTOR是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，從屬于PI3K家族成員，是PI3K/Akt信號(hào)通路的下游效應(yīng)器。mTOR廣泛表達(dá)于細(xì)胞中，調(diào)控著不同細(xì)胞包括存活、增殖在內(nèi)的多項(xiàng)細(xì)胞功能。其中，mTORC1一方面接受細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)著包含5'末端(TOP)mRNAs的翻譯，另一方面充當(dāng)調(diào)控帽依賴RNA翻譯起始的級(jí)聯(lián)信號(hào)通

3、路的中樞。4E-BP1是mTOR下游的關(guān)鍵信號(hào)蛋白，也是蛋白質(zhì)合成中的負(fù)向調(diào)控因子，它可抑制eIF-4G與eIF-4E的結(jié)合，最終抑制蛋白質(zhì)翻譯的起始過(guò)程。當(dāng)4E-BP1被mTOR磷酸化后，從eIF-4E解離下來(lái)，eIF-4E去抑制，eIF-4E從而與eIF-4A、eIF-4G結(jié)合，形成eIF-4F復(fù)合物，并與mRNA帽結(jié)合，啟動(dòng)帽依賴性的蛋白質(zhì)翻譯起始。同時(shí)，mTORC1還可以磷酸化p70核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)，從而磷酸化

4、S6蛋白的小核糖體亞基，與其他激酶一起促進(jìn)蛋白翻譯。在前列腺癌和其它多種實(shí)體瘤中，mTOR是與腫瘤生成和治療抵抗均相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。且在前列腺癌中，mTOR信號(hào)通路整合細(xì)胞存活相關(guān)信號(hào)，mTOR及其下游關(guān)鍵蛋白多處于活化狀態(tài)。
　　和細(xì)胞增殖一樣，細(xì)胞凋亡也是一個(gè)受多條信號(hào)通路多個(gè)基因調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，在受到有害或異常刺激時(shí)，細(xì)胞通過(guò)凋亡進(jìn)行自我破壞以維持自體穩(wěn)態(tài)，是一種保護(hù)性的生物學(xué)反應(yīng)。凋亡通路的失調(diào)可能通過(guò)促進(jìn)異常細(xì)胞的過(guò)度增殖

5、，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，所以凋亡信號(hào)通路是腫瘤治療的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。
　　川芎是一種中藥植物，藁本屬，傘形科，因其良好的促血液循環(huán)作用而頗受關(guān)注。川芎最主要的有效成分是川芎嗪(TMP,2，3，5，6-Tetramethylpyrazine)，川芎嗪通過(guò)抗血小板聚集和調(diào)節(jié)微動(dòng)脈小動(dòng)脈可以改善微循環(huán)，并且川芎還具有抗氧化，抗纖維化，以及鈣拈抗等作用。鹽酸川芎嗪已經(jīng)作為一種預(yù)防和治療血管疾病的藥物在臨床廣泛使用多年，且近年來(lái)研究顯示川芎嗪還

6、有抑制腫瘤生長(zhǎng)、多藥耐藥、遷移等多重抗腫瘤效應(yīng)。
　　本研究中，我們首先用MTT比色法觀察鹽酸川芎嗪對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的影響，然后對(duì)鹽酸川芎嗪抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖作用的機(jī)理進(jìn)行了探討:(1)通過(guò)Western Blot檢測(cè)mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白mTOR、p70S6K、S6、eIF4E和4E-BP1的磷酸化表達(dá)，且通過(guò)7-甲基-GTP Pull down繼續(xù)探討鹽酸川芎嗪對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞翻譯起始蛋白表達(dá)的影響

7、，最后通過(guò)LUC熒光素酶證實(shí)PC-3細(xì)胞蛋白合成率變化;(2)采用流式細(xì)胞術(shù)和Hochest33342染核觀察細(xì)胞凋亡情況，以及western blot觀察凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。這些研究將為鹽酸川芎嗪治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)和支持。
　　方法：
　　1.0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細(xì)胞48h和72h，刺激人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HCT-116和前列腺上皮細(xì)胞RWPE

8、-148h，MTT檢測(cè)鹽酸川芎嗪對(duì)其增殖能力的影響。
　　2.0、4.8、7.2mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細(xì)胞48h:
　　(1)檢測(cè)對(duì)mTOR信號(hào)通路的影響Western Blot檢測(cè) mTOR、p70S6K、S6、eIF4E和4E-BP1蛋白及蛋白磷酸化的表達(dá)(磷酸化刺激時(shí)間45min)。
　　7-甲基-GTP pulldown檢測(cè)4EBP1和eIF4E蛋白表達(dá)(刺激時(shí)間為24h)。
　　LUC熒光

9、素酶檢測(cè)細(xì)胞蛋白合成率變化。
　　RT-PCR檢測(cè)熒光素酶基因的變化。
　　(2)檢測(cè)對(duì)凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況.
　　Hochest33342染核后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變。
　　Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　3.數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS17.0)處理，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.0、

10、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細(xì)胞、人結(jié)腸直腸癌HCT-116細(xì)胞，和前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞后，PC-3和HCT-116兩種腫瘤細(xì)胞增殖明顯受抑制(p＜0.05)，且PC-3細(xì)胞呈濃度和時(shí)間依賴性(p＜0.05)，而RWPE-1增殖無(wú)明顯影響(p＞0.05，MTT檢測(cè))。
　　2.4.8mM和7.2mM的鹽酸川芎嗪
　　(1)對(duì)mTOR信號(hào)通路的影響明顯

11、抑制mTOR及其下游關(guān)鍵蛋白(p70S6K、S6、eIF4E、4E-BP1)的磷酸化(p＜0.01)，而這些蛋白本身的表達(dá)水平無(wú)明顯變化(p＞0.05，western blot檢測(cè))。
　　明顯上調(diào)4E-BP1與eIF4E的結(jié)合，下調(diào)eIF4E的表達(dá)(p＜0.05，7-甲基-GTP Pulldown檢測(cè))。
　　明顯抑制Luciferase報(bào)告基因的表達(dá)(p＜0.05，LUC熒光素酶檢測(cè))，但其Luciferase mRNA

12、水平無(wú)明顯變化(p＞0.05，RT-PCR檢測(cè))。
　　(2)對(duì)凋亡的影響促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞的凋亡(p＜0.05，流式細(xì)胞術(shù))誘發(fā)前列腺癌PC-3細(xì)胞核的形態(tài)改變（Hochest33342染核，熒光顯微鏡觀察）。
　　上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)(p＜0.05)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)(p＜0.05，western blot檢測(cè))。
　　結(jié)論：
　　鹽酸川芎嗪對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞