一種通過GFP結(jié)合蛋白強化GFP三分子熒光互補作用方法的建立與驗證.pdf

1、目的:
　　將改造后的GFP（super-fold GFP，簡寫為sfGFP）作為三分子熒光互補方法的基礎(chǔ)，通過應(yīng)用多種GFP結(jié)合蛋白，觀察其對熒光互補的影響，篩選并驗證可強化熒光互補作用的GFP結(jié)合蛋白，優(yōu)化GFP三分子熒光互補技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用。
　　方法:
　　1.綠色熒光蛋白篩選:細胞轉(zhuǎn)染實驗檢測，選取野生型GFP(EGFP)與結(jié)構(gòu)改造后的superfolderGFP(sfGFP)相比下，熒光強度

2、的差異。
　　2.構(gòu)建我們自己的三分子熒光互補技術(shù)體系:將sfGFP拆分為三部分（GFP1-9，GFP10和GFP11），建立GFP三分子熒光互補作用的實驗體系。
　　3.GFP結(jié)合蛋白的篩選:利用多種GFP結(jié)合蛋白在細胞水平對GFP三分子熒光互補作用進行檢驗，篩選出可強化熒光互補作用的GFP結(jié)合蛋白;通過GFP結(jié)合蛋白與重組裝的GFP共定位，探索GFP結(jié)合蛋白是否可以結(jié)合到三拆分后重新組裝的GFP上去;再通過體外實驗對細胞

3、實驗結(jié)果進行驗證;最后通過GFP結(jié)合蛋白與GFP的結(jié)合實驗，發(fā)現(xiàn)GFP結(jié)合蛋白與GFP的結(jié)合位點。
　　4.共聚焦研究GFP重組裝的定位能力:以LNMB1為研究對象使用共聚焦顯微鏡研究重新組裝的綠色熒光是否與具有特征性定位的蛋白位置相同。
　　5.GFP三分子熒光互補技術(shù)的衍生:將三分子互補技術(shù)拓展到五分子互補，并進行檢驗。
　　結(jié)果:
　　1:通過細胞實驗得出sfGFP比野生型EGFP具有更強的熒光，推斷sfG

4、FP更加適合用于研究。
　　2.成功構(gòu)建GFP三分子熒光互補技術(shù)體系，三拆分后的GFP可以通過相互作用的蛋白牽引，重新組裝得到綠色熒光。
　　3.發(fā)現(xiàn)了三種GFP結(jié)合蛋白，DARPin-GFP、GFP-enhancer和NbsfGFP能夠在細胞中對三拆分后的GFP重組起到2-4倍的加強效果;GFP結(jié)合蛋白與GFP可共定位，推論出，是GFP結(jié)合蛋白的直接結(jié)合導(dǎo)致GFP熒光強度增強，而排出其它增強因素;體外實驗進一步證實了細胞實

5、驗結(jié)果;而且也揭示了GFP結(jié)合蛋白與GFP結(jié)合部位與GFP10-11這段結(jié)構(gòu)有緊密聯(lián)系。
　　4.激光共聚焦觀察，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)重新組裝的GFP定位到具有特征性的核膜(LNMB1)上，猜測，也許是實驗細胞選取或者是融合蛋白的順序影響了實驗結(jié)果。
　　5.GFP三分子熒光互補衍生成5個分子，無熒光，或許是蛋白較多，空間位阻效應(yīng)較嚴(yán)重，阻礙了GFP重新結(jié)合成完整的熒光分子。
　　結(jié)論:
　　通過熒光對比，我們鎖定了熒光強