新城疫病毒HN和F蛋白的表達及對肝癌細胞多核融合作用的研究.pdf

1、新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）是不分段的、單股負鏈RNA病毒，屬副粘病毒科腮腺炎病毒屬。NDV 具有天然的在人腫瘤細胞選擇性復制的特點，由于對人類無致病原性，近年來在腫瘤治療方面的應用得到關注。 目前NDV 用于腫瘤治療主要集中在兩個方面：1）在臨床上用弱毒株NDV感染患者自體腫瘤細胞制成瘤苗，對患者進行術后主動免疫治療。2）利用強毒株NDV 直接進行腫瘤的病毒治療以及將其作為載體攜帶外源基

2、因用于基因治療。 NDV 的RNA 基因組全長約15kb，包含6 個基因，其中編碼的血凝素-神經(jīng)氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase, HN）和融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）表達在病毒的包膜上。HN 蛋白的功能體現(xiàn)在三個方面：①受體識別：識別宿主細胞表面含唾液酸的糖蛋白受體，介導病毒顆粒吸附于靶細胞膜上，從而啟動感染過程；②神經(jīng)氨酸酶活性：能水解宿主細胞內新合成糖蛋白上的唾液酸，因此在病毒

3、復制周期中能抑制新合成病毒顆粒的聚集以及促進新合成病毒粒子從感染的細胞中釋放。③促膜融合：和F 蛋白相互作用，激活F 蛋白的促膜融合作用，最終NDV 膜和靶細胞膜相互融合，導致病毒進入胞漿復制。F 蛋白除了促膜融合作用外，其氨基酸序列對病毒毒力也有很大影響。 基于HN 和F 蛋白相互作用具有促進細胞膜融合的作用，本課題研究的主要目的是：通過表達NDV Italien 株的HN 和F 蛋白，研究他們各自的功能及相互作用，進一步研究

4、HN 和F 蛋白共表達對肝癌細胞的促膜融合作用，為肝癌的治療提供新思路。 本課題共分三個部分：①構建NDV Italien 株的HN 基因的真核表達載體，通過western blot、免疫熒光技術鑒定HN 蛋白的表達，進一步檢測HN蛋白的促紅細胞凝集功能和神經(jīng)氨酸酶活性。②構建NDV Italien 株的F 基因的真核表達載體，通過免疫熒光技術鑒定F 蛋白的表達，通過將HN 和F真核表達載體共轉染COS-7 細胞，用蘇木精染色法

5、檢測F 蛋白的促膜融合作用。③通過將HN 和F 真核表達載體共轉染HHCC 細胞，用蘇木精染色法檢測HN 和F 蛋白相互作用對肝癌細胞HHCC 的多核融合作用。 我們首先通過RT-PCR 的方法克隆了NDV Italien 株的HN 和F 基因，并各自分別引入了EcoR V 和Xbal I 兩個酶切位點，連接T 載體、測序。然后通過分別雙酶切HN、F 基因和真核表達載體pcDNA3.1，將HN、F 基因連入到pcDNA3.1 載

6、體中，通過PCR 和酶切鑒定證明，HN 和F 基因正確地連入到pcDNA3.1 載體中，分別命名為pcDNA3.1-HN 和pcDNA3.1-F。將構建的兩個真核質粒分別轉染COS-7 細胞，western blot、免疫熒光顯微鏡技術證明HN 和F 蛋白都在COS-7 細胞中得到了瞬時表達。功能試驗結果表明，HN蛋白具有促紅細胞凝集和神經(jīng)氨酸酶的功能，HN 和F 蛋白相互作用具有促膜融合的功能。進一步將HN和F共轉染肝癌細胞HHCC，