新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表達與免疫活性檢測.pdf

1、新城疫（Newcastle disease,ND）被稱為亞洲雞瘟或者偽雞瘟。是由新城疫病毒（NDV）引起的急性高度接觸性傳染病。目前，新城疫在我國仍然十分流行，給我國的養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重威脅我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，故新城疫的防治十分重要。
　　在我國主要以疫苗接種來防控該病的蔓延，使用傳統(tǒng)疫苗可以預防新城疫，但與傳統(tǒng)疫苗相比，將NDV基因組中一個或多個保護性抗原在原核或真核細胞中表達從而制備成亞單位疫苗更具有安全性能高、穩(wěn)

2、定性好、易于批量生產及生產成本低等優(yōu)點。ND亞單位疫苗的制備主要以病毒囊膜表面的致病性糖蛋白為主。近年來新城疫亞單位疫苗的研究熱點仍以HN蛋白為主，它與病毒的致病性和免疫原性密切相關，是決定病毒毒力的重要因素。而大量制備HN蛋白主要以大腸桿菌表達系統(tǒng)為主，大腸桿菌作為外源蛋白表達系統(tǒng)具有培養(yǎng)所需碳源價格便宜、細胞生長迅速和易于規(guī)?；囵B(yǎng)等優(yōu)點。然而，目前在大腸桿菌中高效表達可溶性外源蛋白還比較困難。有研究表明，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，采用

3、融合標簽與目的基因一起進行融合表達可以提高目的蛋白的可溶性表達量，然而，目前沒有一個標簽可以促進所有目的蛋白的可溶性表達。
　　本試驗采用融合表達的方法將人工合成的HN-SF基因分別與Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB這10種融合標簽基因采用柔性接頭進行連接，構建10個重組表達載體，經(jīng)菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定及測序正確后，將這1

4、0個重組表達載體分別轉入大腸桿菌BL21中，用不同條件進行誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，并用生物軟件ImageJ分析并選出最佳誘導蛋白表達的條件，篩選出能夠顯著促進重組HN蛋白可溶性表達的標簽。為了消除標簽自身大小對表達量的影響，采用Western blot對所表達蛋白的含量進行定量分析。同時檢測純化的重組HN蛋白能否形成衣殼樣納米顆粒，用透射式電子顯微鏡觀察其形態(tài)結構，純化的重組HN蛋白用免疫印跡和間接ELISA檢測其免疫活性

5、。
　　結果表明，成功將合成的HN-SF基因連接到帶有標簽的10個表達載體上，經(jīng)菌液PCR、雙酶切和測序鑒定正確，表明成功構建含有6×His-Grifin-TEV-HN-SF、6×His-GST-TEV-HN-SF、6×His-MBP-TEV-HN-SF、6×His-NusA-TEV-HN-SF、6×His-SUMO-TEV-HN-SF、6×His-Thioredoxin-TEV-HN-SF、6×His-ProteinG-TEV-

6、HN-SF、6×His-γ-crystallin-TEV-HN-SF、6×His-ArsC-TEV-HN-SF、6×His-PpiB-TEV-HN-SF的10個表達載體。用不同的條件進行誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測并用生物軟件選出最佳誘導重組HN蛋白表達的條件為：誘導溫度為16℃、IPTG的濃度為0.4mmol/L、Amp的濃度為200μg/mL和LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。在最佳誘導條件下顯示：10個重組表達載體中只有N-端連接Pro

7、teinG標簽沒有檢測到目的蛋白的表達，其余9個重組載體都有目的蛋白的表達。用ImageJ軟件對可溶性表達量進行定量分析表明，pET3-HN可溶性表達量最高（62.7％），其次分別為pET2-HN（42.2%）、pET5-HN（40.8%）、pET6-HN（40.4%）、pET1-HN（39.5%）、pET7-HN（36.0%）、pET10-HN（27.3%）、pET9-HN（26.8%）、pET4-HN（5.2%）。篩選出融合標簽MB

8、P能夠有效促進HN蛋白可溶性表達。為了消除標簽自身大小對表達量的影響，選出可溶性表達量最高的兩組（GST組和MBP組），用抗His標簽的抗體對其可溶性表達量進行定量分析，Western blot結果表明最佳融合標簽是MBP標簽。隨后對重組HN蛋白進行純化，SDS-PAGE分析無其它雜帶，表明純化的蛋白純度高，用超濾管濃縮純化產物，其濃度達到1.6mg/mL；在透射電子顯微鏡下觀察重組HN蛋白能組裝成衣殼樣納米顆粒的結構，經(jīng)Western