PTEN敲除小鼠前列腺癌模型的蛋白組學分析靶基因Chop的確定及誘導性表達c-myc細胞系的建立.pdf

1、本文對PTEN敲除小鼠前列腺癌模型的蛋白組學分析靶基因Chop的確定及誘導性表達c--myc細胞系的建立進行了研究。本研究分為四個部分：
　　 第一部分：PTEN敲除小鼠前列腺癌模型的蛋白組學分析。
　　 目的：通過高通量的質譜技術以及SILAC精確的計量技術，使蛋白組學能夠應用于前列腺癌蛋白質組的系統(tǒng)分析，明確在腫瘤進程中有意義的蛋白指標。
　　 方法：使用精氨酸10、賴氨酸8標記的SILAC培養(yǎng)液對PTEN敲

2、除小鼠前列腺癌細胞株進行培養(yǎng)。RIPA液對細胞進行裂解。正常組織、腫瘤標本的石蠟切片及小鼠前列腺癌細胞系提取蛋白，胰蛋白酶消化，肽鏈的分離及液相質譜分析，軟件數(shù)據(jù)分析。
　　 結果：數(shù)據(jù)分析最終得到約2000種蛋白。其中腫瘤標本中明顯上調蛋白占264種，明顯下調蛋白303種。PTEN敲除標本中有關細胞粘附的蛋白表達上調（膠原蛋白、層粘連蛋白、整合素…）;有關蛋白質運輸(RAB)上調;調節(jié)細胞周期的部分蛋白下調（MAPK7、胞裂蛋

3、白及組蛋白），有關未折疊蛋白反應中的一系列基因下調。
　　 結論：利用SILAC技術的定量蛋白組學研究能夠精確地對比腫瘤組織與正常組織之間的蛋白水平差異，能夠更好地了解前列腺癌進展的分子生物學機制，為前列腺癌早期的生物學標志物的篩選、尋找有效地靶向治療基因及對于前列腺癌治療效果進行有效的監(jiān)測建立了良好的基礎。
　　 第二部分：抑制PTEN表達后前列腺癌細胞22Rv1的變化。
　　 目的：結合蛋白組學分析結果，PT

4、EN基因的缺失可能會引起有關未折疊蛋白反應的基因的改變，從而對細胞的增殖與凋亡產(chǎn)生影響。目前PTEN與未折疊蛋白反應中有關凋亡的Chop基因之間的關系尚無有關報道。
　　 方法：實驗采用前列腺癌細胞株22Rv1，首先利用siRNA干擾技術沉默22Rv1細胞中的PTEN基因。MTT檢測22Rv1細胞沉默PTEN基因后的細胞活力。流式細胞儀檢測細胞凋亡。使用realtimePCR技術檢測未折疊蛋白反應中Chop基因，觀察其隨著PTE

5、N基因沉默后的表達情況。利用WesternBlot檢測蛋白表達情況。
　　 結果：抑制或沉默PTEN后前列腺癌細胞22Rv1的凋亡減少，細胞活力升高。 westernBlot可見p-AKT473表達水平降低。Realtime PCR可見未折疊蛋白反應中的Chop基因mRNA水平下降，westernblot檢測后可見Chop基因隨PTEN的抑制而下調。
　　 結論：結合前期蛋白組學分析結果，抑制PTEN基因后可見未折疊蛋白

6、反應中有關細胞凋亡的Chop基因下調，提示Chop基因可能在前列腺癌細胞的增殖及其凋亡中發(fā)揮作用。
　　 第三部分：Chop基因對前列腺癌細胞生長和凋亡的影響。
　　 目的：Chop，又稱為gadd153(DNA損傷誘導轉錄因子3)是由于內質網(wǎng)在應激刺激下穩(wěn)態(tài)失衡所誘導高表達的基因。我們研究表明隨著PTEN的下調，Chop基因隨之下調。chop基因的表達與細胞凋亡有關，但是chop基因在前列腺癌細胞中與細胞凋亡及增殖的關

7、聯(lián)還未被證實。
　　 方法：實驗采用前列腺癌細胞株22Rv1，通過siRNA沉默22Rv1細胞中的Chop基因，MTT檢測細胞活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡。利用攜帶Chop基因的質粒轉染進入22Rv1，48小時候利用WesternBlot檢測蛋白表達情況。同時MTT檢測細胞活力，流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　 結果：⑴抑制或沉默Chop基因后前列腺癌細胞22Rv1細胞凋亡減少、細胞活力增多。過表達Chop基因后可見細胞活

8、力降低，細胞凋亡增加。⑵過表達Chop基因后可見pAkt473、Ki67表達降低。
　　 結論：我們的數(shù)據(jù)顯示抑制PTEN表達后chop基因表達減少，細胞凋亡隨之減少，細胞活力升高。過表達Chop后細胞凋亡增多，細胞活力降低。隨著Chop表達增多，pAkt473基因與Ki67基因表達顯著下降。證明了在Chop基因可能是引起細胞凋亡過程中的一重要因素，通過降低pAkt473的表達水平，Chop基因能夠促使細胞進入凋亡。同時，過表達

9、Chop基因可見Ki67基因表達下調，推測Chop基因可能與細胞增殖有關。
　　 第四部分：構建出可誘導表達c-myc基因的22Rv1細胞系。
　　 目的：Myc已知可直接或間接調節(jié)眾多基因及途徑的轉錄過程。本實驗在此基礎上結合可調控基因治療的觀念與手段，采用四環(huán)素誘導表達的載體系統(tǒng)，創(chuàng)建可誘導表達c-myc基因的22Rv1前列腺癌細胞系。
　　 方法：實驗采用前列腺癌細胞株22Rv1，首先構建穩(wěn)定轉染的攜帶調節(jié)