結(jié)腸癌SW480細胞中S100A1、S100A6對CacyBP-SIP核轉(zhuǎn)位的影響.pdf

1、鈣周期素結(jié)合蛋白(calcylinbindingprotein,CacyBP)是Filipek等首先從艾氏腹水瘤細胞中發(fā)現(xiàn)的一種約30kDa的蛋白質(zhì),其可以和鈣周期素(calcyclin或S100A6)結(jié)合,故此得名;之后在研究P53誘導(dǎo)的β-catenin泛素化降解新通路時,發(fā)現(xiàn)一種可以與sina的同源基因Siah-1(seveninabsentiahomolog1)結(jié)合的蛋白,被命名為SIP(Siah-1interactingpro

2、tein),經(jīng)序列分析,SIP和鼠CacyBP93％相同,因此,認為SIP即為人CacyBP。目前就把鈣周期素結(jié)合蛋白命名為CacyBP/SIP。
　　CacyBP/SIP是S100家族的靶蛋白之一,可以和S100A1、S100A6、S100A12、S100B及S100P結(jié)合。同時,S100蛋白又是以EF-手形(EF-hand)結(jié)構(gòu)為特點的鈣結(jié)合蛋白家族成員之一,當其和Ca2+結(jié)合后,構(gòu)象發(fā)生改變,結(jié)合相應(yīng)的靶蛋白,發(fā)揮自身特異的

3、生物學效應(yīng)。此外,研究顯示,神經(jīng)元細胞未受刺激時,Ca2+濃度為50nM,CacyBP/SIP位于細胞質(zhì)中;用KCI處理細胞后使Ca2+濃度升至300nM,CacyBP/SIP環(huán)狀定位于核周,即神經(jīng)元細胞中Ca2+濃度的變化可以誘導(dǎo)CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位,那么Ca2+是否通過與S100結(jié)合,激活S100活性,并通過S100與CacyBP/SIP結(jié)合,使CacyBP/SIP作為第三信使進入細胞核傳遞信號,本課題將對此進行探討。

4、>　　目的
　　1.結(jié)腸癌SW480細胞中Ca2+濃度變化對CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位的影響。2.結(jié)腸癌SW480細胞中,核轉(zhuǎn)位前后S100A1、S100A6與CacyBP/SIP的結(jié)合情況及結(jié)合量的變化情況;抑制相應(yīng)S100蛋白表達,觀察其對CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位的影響。
　　方法
　　1.給予不同濃度Ca2+載體ionomycin(0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L

5、)刺激結(jié)腸癌SW480細胞,通過間接免疫熒光,激光共聚焦觀察CacyBP/SIP在細胞內(nèi)的定位變化,并動態(tài)掃描細胞內(nèi)熒光強度的變化,記錄細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的相對水平。2.給予Ca2+載體ionomycin(5μmol/L)和不同濃度Ca2+拮抗劑BAPTA/AM(0μM、5μM、10μM、25μM)共同刺激結(jié)腸癌SW480細胞,通過間接免疫熒光,激光共聚焦觀察Ca2+濃度降低后CacyBP/SIP在細胞內(nèi)的定位變化,并動態(tài)掃描細胞內(nèi)

6、熒光強度的變化,記錄細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的相對水平。3.采用MTT法檢測細胞的活力及用AnnexinV/PI法檢測細胞凋亡的情況,排除由于細胞內(nèi)Ca2+超載對本實驗的影響。4.升高Ca2+濃度,采用免疫共沉淀法檢測核轉(zhuǎn)位前后S100A1、S100A6與CacyBP/SIP的結(jié)合情況及結(jié)合量的變化情況。5.設(shè)計針對S100A6的三組siRNA,通過Real-TimePCR和Westernblot方法篩選出一組沉默效果最好的siRNA,轉(zhuǎn)

7、染結(jié)腸癌SW480細胞,免疫熒光檢測抑制S100A6表達對CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位的影響。
　　結(jié)果
　　1.CacyBP/SIP主要位于細胞質(zhì)中(未給刺激時),在給予ionomycin刺激后CacyBP/SIP發(fā)生核轉(zhuǎn)位,并于5μmol/L刺激時核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象最為明顯(CacyBP/SIP主要位于細胞核中),隨ionomycin濃度(10μmol/L)進一步升高,CacyBP/SIP又重新分布于細胞質(zhì)和細胞核;同時用iono

8、mycin處理細胞后細胞內(nèi)游離Ca2+濃度逐漸增高,且于5μmol/Lionomycin刺激時最高,之后隨ionomycin濃度升高Ca2+濃度趨于平穩(wěn)(P=0.000)。這一結(jié)果說明當細胞內(nèi)Ca2+濃度升高后CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細胞核,且隨著Ca2+濃度的進一步升高,CacyBP/SIP又重新分布于細胞質(zhì)和細胞核。
　　2.隨BAPTA/AM刺激濃度的升高發(fā)生核轉(zhuǎn)位的CacyBP/SIP又重新聚集細胞質(zhì);同時細胞內(nèi)游離Ca

9、2+濃度隨BAPTA/AM刺激濃度的升高逐漸降低(P=0.000)。這一結(jié)果說明細胞內(nèi)Ca2+濃度的降低可以使發(fā)生核轉(zhuǎn)位的CacyBP/SIP返回細胞質(zhì)。
　　3.MTT法檢測顯示處理組SW480細胞的細胞存活率與未處理組無顯著差異(P=0.985);AnnexinV/PI法檢測也未發(fā)現(xiàn)明顯的早期凋亡的情況(P=0.168)。這一結(jié)果說明細胞內(nèi)Ca2+超載對本實驗結(jié)果沒有影響,實驗結(jié)果準確可靠。
　　4.發(fā)生核轉(zhuǎn)位前后S10

10、0A1、S100A6都與CacyBP/SIP結(jié)合,但結(jié)合量及其變化明顯不同;S100A1與CacyBP/SIP的結(jié)合量少,且核轉(zhuǎn)位前后結(jié)合量之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),這提示S100A1可能對CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位沒有影響或影響很小;但是在發(fā)生核轉(zhuǎn)位后S100A6與CacyBP/SIP的結(jié)合量較轉(zhuǎn)位前明顯增加(P<0.05),且明顯高于轉(zhuǎn)位后S100A1的結(jié)合量(P<0.05),這提示S100A6可能在CacyBP/SI

11、P的核轉(zhuǎn)位中發(fā)揮了重要作用。
　　5.通過Real-TimePCR和Westernblot方法檢測發(fā)現(xiàn)siRNA-S100A6-2組沉默效果最好,抑制率分別為87.9%和85.0%,故選用siRNA-S100A6-2干預(yù)SW480細胞,使S100A6蛋白表達受到抑制,再給予5μmol/Lionomycin刺激時,核轉(zhuǎn)位受到明顯抑制,CacyBP/SIP定位于細胞質(zhì)和細胞核,并未完全轉(zhuǎn)位至細胞核中,這進一步說明S100A6在Cacy

12、BP/SIP的核轉(zhuǎn)位中發(fā)揮了重要作用。
　　結(jié)論
　　1.在結(jié)腸癌SW480細胞中,當細胞內(nèi)Ca2+濃度升高后CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細胞核,隨著Ca2+濃度的進一步升高,其又重新分布于細胞質(zhì)和細胞核,且Ca2+濃度降低亦可使發(fā)生核轉(zhuǎn)位的CacyBP/SIP返回細胞質(zhì),即在結(jié)腸癌SW480細胞中,隨著細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化,CacyBP/SIP發(fā)生了進出核的轉(zhuǎn)位。
　　2.在結(jié)腸癌SW480細胞中,核轉(zhuǎn)位前后S10