RIP3對膠質母細胞瘤細胞增殖、死亡和化療敏感性的作用及其作用機制的研究.pdf

1、目的：膠質母細胞瘤或多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是最為常見，惡性程度最高的膠質瘤類型。同其他腫瘤一樣，GBM的發(fā)生、發(fā)展以及對各種輔助治療方式的抵抗與腫瘤細胞內多基因的調節(jié)及多種因素相互作用有關。基因治療被認為是各種惡性腫瘤非常有前景的治療方式，慢病毒載體介導的基因治療因其較高的轉導效率，較好的操控性，既可感染分裂期也可感染非分裂期細胞，并可將外源基因整合入目的細胞基因組中，長期穩(wěn)定地表達

2、外源基因，是基因治療中非常有力的工具；慢病毒載體還可介導RNA干擾，從而持續(xù)穩(wěn)定地抑制靶基因的表達。凋亡是一種程序性細胞死亡，并且已得到了非常廣泛而深入地研究。一般認為壞死是一個不可調控的、非程序性的細胞死亡方式，然而，研究證實，壞死可能至少部分是通過程序調控而形成的，這種細胞死亡被命名為稗序件壞死。RIP3，屬于RIP家族成員，是Ser/Thr蛋白激酶，因其結構中含有RIP家族同源激酶結構域而得名。RIP3在人體多個正常組織中有表達，

3、而在多種惡性腫瘤細胞系中卻表達下降或缺失，研究發(fā)現，RIP3是程序性細胞壞死過程中的關鍵蛋白。GBM的發(fā)生、發(fā)展以及對放化療的抵抗與腫瘤細胞凋亡功能失調有重要的關系。雖然凋亡過程有缺陷，幾乎所有的GBM均表現出不同程度的瘤內壞死。另外，某些抗腫瘤的輔助治療方式通過誘導腫瘤壞死對多種惡性腫瘤產生良好的治療效應。誘導腫瘤細胞壞死從而清除腫瘤細胞在近年來逐漸得到重視。然而，通過誘導腫瘤細胞壞死來治療惡性腫瘤的研究鮮有報道，且尚未有壞死關鍵因子

4、RIP3對惡性膠質瘤作用的研究。我們通過構建重組人RIP3慢病毒過表達載體和慢病毒shRNA干擾載體，轉導GBM細胞株U251，調控RIP3基因在GBM細胞中的表達，研究RIP3對惡性膠質瘤細胞增殖、死亡的影響及對臨床標準的惡性膠質瘤化療藥替莫唑胺敏感性的影響，并探討其作用機制，為RIP3在膠質母細胞瘤治療中的應用提供依據。
　　 方法：
　　 1.使用Gateway技術構建人RIP3慢病毒過表達載體。使用酶切連接技術構

5、建RIP3慢病毒干擾載體。
　　 2.攜帶人RIP3基因的重組HIV-1慢病毒與攜帶RIP3 shRNA序列的慢病毒分別轉導野生型U251(U251-WT)細胞株，通過G418篩選轉導后的U251，Western blot鑒定RIP3的表達情況。
　　 3.使用Annexin V/PI雙染法檢測U251-WT細胞、U251-RIP3細胞，U251-shRIP3細胞的死亡情況，進一步使用廣譜Caspase抑制劑zVAD驗證

6、死亡方式。
　　 4.使用CellROXTM Deep Red試劑檢測U251-WT細胞、U251-RIP3細胞，U251-shRIP3細胞中ROS的表達水平，研究ROS在RIP3誘導的細胞死亡中的作用。
　　 5.ELISA法檢測上述U251-WT細胞、U251-RIP3細胞，U251-shRIP3細胞中的TNF-α的分泌情況，研究其在RIP3誘導的細胞死亡中的作用。
　　 6.MTT檢測上述U251-WT細胞

7、、U251-RIP3細胞，U251-shRIP3細胞的生長情況。
　　 7.Western blot法檢測上述三株細胞中PI3K/Akt信號通路中關鍵因子Akt的磷酸化情況。
　　 8.MTT法檢測上述三株細胞對TMZ的敏感性差異。使用Annexin V/PI雙染法檢測U251-WT細胞、U251-RIP3細胞在temozolomide作用下的死亡情況。
　　 9.Western blot法檢測U251-WT，U

8、251-RIP3，U251-shRIP3中PARP-1的表達情況。
　　 結果：
　　 1.成功構建RIP3慢病毒過表達載體和慢病毒shRNA干擾載體，并與第四代包裝質粒共轉導包裝細胞，獲得高達3×108 TU/ml的病毒顆粒。
　　 2.攜帶人RIP3基因的慢病毒與攜帶RIP3 shRNA序列的慢病毒分別轉導U251-WT細胞株，通過G418篩選，分別獲得穩(wěn)定過表達人RIP3基因和RIP3被干擾的細胞株(U25

9、1-RIP3及U251-shRIP3)。
　　 3.過表達RIP3的U251細胞出現腫脹樣死亡，且這種死亡不被廣譜的caspase抑制劑阻斷，Annexin V/PI檢測進一步證實為死亡細胞PI強陽性。過表達RIP3的U251細胞死亡率明顯高于U251-WT及U251-shRIP3，且RIP3過表達誘導U251細胞死亡需要依賴ROS的產生，使用ROS清除劑BHA作用后，其死亡明顯減少。
　　 4.與野生型相比，過表達RI

10、P3的U251細胞TNF-α分泌明顯增加。而U251-WT與U251-shRIP3的 TNF-α分泌無明顯差別。
　　 5.在替莫唑胺(TMZ)作用下，過表達RIP3的U251細胞增殖能力明顯低于U251-shRIP3和U251-WT細胞。且U251-RIP3的細胞死亡率明顯高于U1251-WT細胞。
　　 6.相比U251-WT和U251-shRIP3細胞，過表達RIP3的U251細胞株對 TMZ作用的敏感性增加，這種

11、作用與RIP3影響PARP-1的表達有關。
　　 結論：
　　 1.RIP3可誘導 U251出現壞死。RIP3誘導U251細胞 TNF-α分泌增加，進一步增加ROS產生從而導致細胞壞死。RIP3通過抑制P13K/Akt信號通路而影響U251的增殖、生長。RIP3是GBM基因治療的一個新的的靶分子。
　　 2.RIP3通過影響PARP-1的表達調控U251對 TMZ的敏感性，RIP3是一種新的調控膠質母細胞瘤藥物敏