ATP敏感性鉀通道對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、背景:神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見惡性腫瘤，國際流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)資料顯示，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率居各種腫瘤的第9位；死亡率居第2位。具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高和治愈率低的特點(diǎn)，其預(yù)后極差。提高腦膠質(zhì)瘤的綜合治療效果是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界長期以來努力探索的課題之一，迄今為止現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未找到令人十分滿意的根治方法。因此，研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋求新的治療靶點(diǎn)已成為亟待解決的問題。 離子通道的活動是細(xì)胞增殖存活的基礎(chǔ)之一，其參與電信號的傳導(dǎo)、肌肉收縮

2、、激素分泌、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期和代謝等生物活動過程，并與諸多病理過程密切相關(guān)。離子通道與惡性腫瘤的相關(guān)性研究正日益受到重視。大量的離子通道存在于各個(gè)類型的腫瘤細(xì)胞中，某些特定離子通道可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的膜電壓和Ca2+信號，調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)離子濃度、pH和細(xì)胞體積，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間相互作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和／或凋亡，是維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。 離子通道尤其是鉀離子通道在惡性腫瘤的增殖及細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，

3、鉀通道在此過程中的確切角色和具體的作用機(jī)制尚不明確。ATP敏感性鉀通道（KATP通道）是一種重要的鉀離子通道，其廣泛分布于全身各個(gè)組織器官，如腦垂體、心肌、平滑肌、骨骼肌和胰腺的β細(xì)胞，參與了多種細(xì)胞功能的調(diào)控，同時(shí)也涉及神經(jīng)元再生、死亡及細(xì)胞周期調(diào)控等過程。近年來，KATP通道在惡性腫瘤中的作用逐漸引起人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，KATP通道在某些惡性腫瘤中呈高表達(dá)，可影響抗腦腫瘤藥物的血腦屏障通過率，并參與膀胱癌細(xì)胞的增殖調(diào)控。盡管KAT

4、P通道在腫瘤調(diào)控中的具體作用機(jī)制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不明確，但KATP通道以其在體內(nèi)廣泛性分布、在多種惡性腫瘤組織中高頻率表達(dá)、可調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展與細(xì)胞增殖的特點(diǎn)，已經(jīng)成為無論是從基因水平還是蛋白水平的、極具價(jià)值的惡性腫瘤診治新靶點(diǎn)。 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖受多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，Ras/MAPK（mitogen activated protein kinase）信號通路是其中最為重要的信號通路之一。ERK作為MAPK通路中介導(dǎo)細(xì)胞

5、存活和增殖的重要分子，在腫瘤增殖過程中起到重要作用。因此，在研究KATP通道調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過程的分子機(jī)制時(shí)，我們首選ERK通路。 本研究聚焦于KATP通道對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖調(diào)控的作用機(jī)制，分析KATP通道的功能改變與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系，并探討其調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，為闡明KATP通道對腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)，并為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶標(biāo)。對開展以離子通道為靶點(diǎn)治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供重要的理論依據(jù)。

6、 目的:以ATP敏感性鉀通道（KATP通道）對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控作用為切入點(diǎn)，從KATP通道的電生理學(xué)和分子生物學(xué)特性兩方面入手，采用RNAi、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印記、流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦等技術(shù)，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，分析KATP通道的功能改變與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系，并探討其調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，為闡明神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖機(jī)制提供新的線索，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)。 方法:將膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87與U251置于37℃

7、培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（5% CO2、95%空氣），分別用KATP通道的激動劑二氮嗪（100 uM），KATP通道的阻斷劑甲糖寧（100 uM）或DMSO處理細(xì)胞；或MEK1的阻斷劑U0126預(yù)處理30分鐘后，再分別給予KATP通道的阻斷劑甲糖寧及KATP通道的激動劑二氮嗪；或采用分子生物學(xué)的方法在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)或干擾KATP通道。運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法觀察KATP通道在細(xì)胞中的表達(dá)情況，運(yùn)用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)比較細(xì)胞的增殖情況；運(yùn)用免疫印

8、記方法檢測KATP通道及ERK激酶在不同處理組中表達(dá)水平的差異。運(yùn)用裸鼠成瘤技術(shù)觀察KATP通道的活性改變對膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)增殖情況的影響。運(yùn)用激光共聚焦技術(shù)觀察KATP通道的活性改變對細(xì)胞膜電位及胞內(nèi)鈣濃度的影響。 結(jié)果:數(shù)據(jù)表明，與正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，在患者膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中KATP通道均呈高表達(dá)（p<0．01）。我們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，KATP通道的活性改變可影響膠質(zhì)瘤增殖：過表達(dá)KATP通道或激活KATP通道均可促

9、進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖（過表達(dá)組增殖率為118．33±3．21%，對照組增殖率為100±1．22%；第六天激動劑組U-87與U251增殖率分別為1393．66±30．36%，1567．40±34．36%；對照組增殖率分別為1051．16±67．96%，1163．54±115．49%）；使用RNAi技術(shù)降低KATP通道表達(dá)或抑制KATP通道活性均可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖（RNA干擾組相較于對照組，細(xì)胞的數(shù)目減少了75．48%～81．44%；第六

10、天U-87與U251阻斷劑組增殖率分別為889．08±27．76%，922．10±10．46%；對照組增殖率分別為1051．16±67．96%，1163．54±115．49%）（p<0．01）。同時(shí)在在體成瘤實(shí)驗(yàn)中也得到相同的結(jié)果（U87細(xì)胞的成瘤實(shí)驗(yàn)中，阻斷劑組、激動劑組及對照組的腫瘤重量分別為0．3±0．09g，0．93±0．21g，0．59±0．13g；在U251細(xì)胞的成瘤實(shí)驗(yàn)中，阻斷劑組、激動劑組及對照組的腫瘤重量分別為0．32

11、±0．05g，1．01±0．22g，0．62±0．16g）（p<0．01）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，KATP通道阻斷劑可將膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖（U87細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：阻斷劑組、激動劑組及對照組G0/G1期的百分比分別為63．71±1．56%，49．7±1．27%，56．96±3．34%；S期的百分比為1．96±0．16%，12．91±0．70%，6．21±1．91%；U251細(xì)胞的流式細(xì)胞

12、術(shù)結(jié)果顯示：阻斷劑組、激動劑組及對照組G0/G1期的百分比分別為63．15±1．67%，50．71±1．30%，58．85±1．86%；S期的百分比為1．68±0．27%，13．12±0．31%，9．24±1．05%）。上述結(jié)果證明了KATP通道的確參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過程的調(diào)節(jié)。 為了探討KATP通道調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過程的分子機(jī)制，我們選擇了Ras/MAPK（mitogen activated protein kinase）

13、信號通路ERK激酶作為研究的靶點(diǎn)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KATP通道可以通過影響ERK激酶的活性進(jìn)而調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖：過表達(dá)KATP通道或激活KATP通道可以增加ERK的活性；使用RNAi技術(shù)降低KATP通道表達(dá)或抑制KATP通道活性均可降低ERK活性（p<0．01）。同時(shí)，ERK激酶的阻斷劑（U0126）可以阻斷KATP通道對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，而ERK的結(jié)構(gòu)性激活形式（constitutively activated，CA）

14、可以逆轉(zhuǎn)KATP通道阻斷劑對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用（過表達(dá)CA組的細(xì)胞數(shù)目為對照組的110．99%）（p<0．01）。這些結(jié)果表明，ERK激酶作為下游分子參與了KATP通道對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控。 為了進(jìn)一步探討KATP通道調(diào)節(jié)ERK通路的作用機(jī)制，我們檢測了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的膜電位、胞內(nèi)鈣濃度以及細(xì)胞的旁分泌/自分泌功能的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KATP通道的功能改變未能影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的臘電位、胞內(nèi)鈣濃度以及細(xì)胞的旁分泌／自分泌功能（