Trop2基因促進小鼠心臟c-kit+細胞增殖和抗凋亡作用的研究.pdf

1、目的:心臟祖細胞（CPCs）是一群定居于心臟內(nèi)的具有多向分化潛力的細胞，它的發(fā)現(xiàn)更新了心臟生物學，改變了以往所認為的心臟是一個不可再生器官的觀念。然而，CPCs在心肌組織內(nèi)含量極低，并且對缺血缺氧極為敏感，因此對梗死心肌組織的修復能力有限。CPCs具有多種亞型，其中c-kit+細胞被認為在心肌修復中發(fā)揮主要作用。Trop2是一種多表達于具有旺盛增殖能力的細胞膜表面的糖蛋白，活化Trop2具有促進多種細胞增殖和抗凋亡作用的效應。本研究的目

2、的是調(diào)查具有快速擴增能力的心臟c-kit+細胞是否也表達Trop2，如果表達，Trop2的生物學效應及其相關機制。
　　 方法:
　　 一、觀察小鼠心梗以后Trop2+c-kit+細胞比例變化通過建立小鼠心梗模型，分別應用免疫組織化學和流式細胞術分析心梗急性期內(nèi)Trop2+c-kit+細胞的動態(tài)變化。
　　 二、細胞分離和培養(yǎng)利用免疫磁珠兩步分離法，從正常小鼠心肌組織中分離出Trop2+c-kit+和Trop2-

3、c-kit+細胞，并培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基中保持其未分化狀態(tài)；
　　 三、細胞增殖實驗構建Trop2 shRNA質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體介導將其轉染入Trop2+c-kit+細胞，Western Blot監(jiān)測不同時間點Trop2表達水平，并在相應時間點應用BrdU（bromodeoxyuridine）法檢測細胞增殖能力。
　　 四、細胞凋亡實驗為模擬急性梗死心肌組織的炎性微環(huán)境，利用脂多糖刺激小鼠中性粒細胞，藉此產(chǎn)生條件化培養(yǎng)基，并

4、將含有不同濃度的條件化培養(yǎng)基（CM）分別作用于Trop2+c-kit+細胞和Trop2-c-kit+細胞，應用Annexin V-APC/PI法檢測細胞凋亡率。
　　 五、相關生物學效應機制探討應用Western Blot和免疫復合物激酶分析技術，對可能引起Trop2相關效應的激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K通路的下游分子進行檢測，探索相關效應的生物學機制。
　　 六、體內(nèi)觀察Trop2對小鼠心臟c-kit+

5、細胞的保護作用建立Trop2基因敲除（Trop2-/-）小鼠模型，和野生型小鼠（Trop2+/+）小鼠比較，觀察心肌梗死后c-kit+細胞數(shù)量的動態(tài)變化，同時對兩組小鼠進行生存分析。
　　 結果:Trop2在小鼠心肌組織中僅表達于c-kit+細胞，在正常生理狀態(tài)下，Trop2+c-kit+細胞比例極低，但心肌梗死后含量迅速上升，其上升趨勢和炎性細胞浸潤相關。在細胞水平觀察到，Trop2能促進小鼠心臟c-kit+細胞增殖和在炎性環(huán)

6、境中的抗凋亡能力，這些效應的發(fā)生可能與MAPK通路被激活有關。整體水平亦證實Trop2能提高梗死心肌組織中c-kit+細胞的生存能力；同Trop2-/-小鼠相比，Trop2+/+小鼠在心梗急性期具有更高的存活率。
　　 結論:Trop2通過增強心臟c-kit+細胞增殖和抗凋亡能力，在心梗急性期發(fā)揮著重要的保護作用。利用基因工程的方法使外源性的心臟c-kit+細胞過表達Trop2蛋白，或者使用具有高度選擇性的Trop2受體激動劑活