LCM與RT-PCR聯(lián)合應用分析CDK2AP1mRNA在口腔鱗癌中的表達水平.pdf

1、口腔鱗狀細胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，約占口腔頜面部惡性腫瘤的80％。由于其發(fā)病部位多位于體表或接近體表而嚴重影響患者的生理功能以及社會交往。癌基因的激活與抑癌基因的失活是導致口腔癌的主要病因?？谇话┤笔Щ?（deletedinoralcancer-1,DOC-1）是1995年分離出的一個候選抑癌基因，人DOC-1/CDK2AP1基因位于染色體12q24，其cDNA全長1627bp,共編碼115個氨基酸,其蛋白產(chǎn)物p12CDK2

2、AP1的分子量為12.4kDa。p12CDK2AP1具有腫瘤生長抑制功能，在口腔鱗癌細胞系中表達缺失。
　　激光捕獲顯微切割（LacerCaptureMicrodissection，LCM）技術是1996年開發(fā)的顯微鏡下從組織切片中分離、純化單一類型細胞群或單個細胞的技術，可在基本不損傷細胞內(nèi)分子物質(zhì)和組織形態(tài)的情況下，從細胞群中分離出單個細胞甚至亞細胞結(jié)構的技術。近年來在腫瘤分子生物學研究中廣泛應用，可與各種基于細胞、DNA、R

3、NA及蛋白質(zhì)的實驗技術相結(jié)合，為研究結(jié)果的高精確性和可靠性提供了保證。
　　實驗目的
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在不同分化程度的口腔鱗癌組織中p12CDK2AP1蛋白及DOC-1/CDK2AP1基因mRNA的表達量存在差異，但由于實驗材料為腫瘤及正常組織的標本塊，可能受到組織中異質(zhì)細胞的干擾而影響結(jié)果的可靠性和精確性，本實驗研究的目的是通過LCM技術與半定量RT-PCR相結(jié)合的方法，來精確檢測DOC-1/CDK2AP1基因在

4、不同分化水平的口腔鱗癌患者的腫瘤細胞、間質(zhì)細胞及正常細胞中的mRNA的表達含量是否有區(qū)別，為口腔鱗癌的分子診斷、治療提供依據(jù)。
　　實驗方法
　　1.使用激光捕獲顯微切割技術（LCM）對口腔鱗癌的腫瘤細胞、間質(zhì)細胞及正常細胞進行純化，獲得高度純化的單一目的細胞群。
　　2.設計DOC-1/CDK2AP1基因及內(nèi)參照β-actin的特異性引物，采用半定量RT-PCR的方法檢測不同分化水平的口腔鱗狀細胞癌組織中的腫瘤細胞、

5、間質(zhì)細胞和正?？谇患毎蠨OC-1/CDK2AP1基因mRNA的表達情況。
　　3.PCR所得產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠成像分析系統(tǒng)測定電泳條帶的灰度值，將DOC-1/CDK2AP1與β-actin的灰度值進行對比獲得DOC-1/CDK2AP1電泳條帶的相對灰度值，對所得相對值進行統(tǒng)計學分析。
　　實驗結(jié)果
　　DOC-1/CDK2AP1基因在正常細胞、腫瘤間質(zhì)細胞中的電泳條帶相對灰度值分別為1.49±0.07

6、、1.47±0.10，而在低分化、中分化、高分化口腔癌中的相對灰度值分別為0.95±0.08、1.04±0.06、1.25±0.10。統(tǒng)計分析顯示：DOC-1/CDK2AP1基因mRNA的表達水平在腫瘤組織間質(zhì)細胞與正常組織細胞中無明顯著性差異；在癌細胞中的表達水平與腫瘤組織間質(zhì)細胞、正常組織細胞中分別存在顯著性差異（P＜0.01），其表達水平顯著降低。DOC-1/CDK2AP1基因mRNA在高分化鱗癌中的表達水平高于在中分化鱗癌中的表

7、達水平，存在顯著性差異（P＜0.01）；高分化鱗癌中的表達水平高于在低分化鱗癌中的表達水平，存在顯著性差異（P＜0.01）；、DOC-1/CDK2AP1基因mRNA在中分化鱗癌中的表達水平均數(shù)高于在低分化鱗癌中的表達水平均數(shù)，無顯著性差異（P＞0.05）。
　　實驗結(jié)論
　　本實驗證實DOC-1/CDK2AP1基因mRNA在口腔鱗癌中表達下調(diào)，與腫瘤的惡性程度有一定相關性，中低分化鱗癌中的表達水平低于高分化鱗癌，中低分化鱗癌